摘 要

铁皮石斛是兰科石斛属多年生草本植物，具有重要的药用价值，但自然繁殖率低。随着其药用功效的不断发掘，铁皮石斛的市场需求日益增大，而石斛长久以来一直依靠野生资源，人为过度采挖以及自身繁殖能力低造成了野生铁皮石斛资源濒临灭绝，通过组织培养实现铁皮石斛的快速繁殖亟需解决。本研究以人工播种生成的铁皮石斛茎段为外植体材料，对不同的基本培养基、生长调节剂以及光照条件进行研究，结果表明：MS 6-BA2.0 mg/L NAA 1.0 mg/L banana sauce10%为铁皮石斛最佳诱导培养基，以MS培养基为基本培养基的铁皮石斛圆球茎诱导率最高且生长状态最好，MS培养基同样是圆球茎分化、增殖以及生根的最佳基本培养基；圆球茎增殖需要植物生长调节剂的最佳组合为NAA 0.4mg/L 6-BA 0.4mg/L KT 0.2 mg/L；铁皮石斛的原球茎增殖、分化较为合适的光照强度分别为500 Lx和2500Lx，光照时间12h；铁皮石斛生根所需植物生长调节剂NAA的最适浓度为0.8 mg/L。

关键词：铁皮石斛；组织培养；增殖；分化

TIN CAULIS DENDROBII TISSUE CULTURE

ABSTRACT

Dendrobium officinale belonging to Dendrobium SW.(Orchidaceae), is aperennial herbaceous plant，behaving an impact medicinal value but a low propagate ability. Requirements for Dendrobium are increasing daily with the medicinal effect developing. The supply of D. officinale used to mainly rely on the wild resources，which led people to excavate it excessively. In addition, its natural reproduction speed was extremely slow. As the result, the wild resource was under the threat of extinction. So the tissue culture program is imperative. We used the stems producing by artificial seeding as the explants to study the tissue culture of D. officinale under different conditions. The main results were as follow: the suitable introduce cluture medium is MS 6-BA2.0 mg/L NAA 1.0 mg/L banana sauce10%; MS medium is the best basic medium for induction, propagation and differentiation; the suitable hormone group is NAA 0.4mg/L 6-BA 0.4mg/L KT 0.2 mg/L; the optimum light strength are 500Lx and 2500 Lx for propagation and differentiation respectively, and 12h lightning is most optimum; concentration about NAA for rooting medium is 0.8mg/L.

Key words:Dendrobium;  tissue culture;   propagation; differentiation

目 录

1 文献综述 5

1.1 铁皮石斛生物学特征 6

1.1.1形态特征 6

1.1.2生境特点 7

1.1.3 地理分布 7

1.2 铁皮石斛快速繁殖研究 8

1.3 铁皮石斛次生代谢产物研究 9

1.4 一次性成苗技术 10

1.4.1 一次性成苗 10

1.4.2 一次性成苗相关研究进展 10

1.4.3 一次性成苗技术的应用前景 11

1.5 国内外研究动态 11

1.6铁皮石斛的组织培养 12

1.6.1外植体 12

1.6.2 培养基 12

1.6.3 培养条件 13

1.7 铁皮石斛组织培养技术在生产上的重要性 14

1.8 研究目的和意义 17

2 实验材料及方法 18

2.1 实验材料 18

2.2 实验方法 18

2.2.1 果实消毒及播种 18

2.2.2 组培条件的优化 19

3 实验结果及分析 21

3.1芽分化培养基的筛选 21

3.2不同基本培养基对铁皮石斛原球茎诱导的影响 21

3.3不同激素处理对铁皮石斛原球茎增殖的影响 22

3.4不同基本培养基对铁皮石斛原球茎分化的影响 23

3.5光照强度对铁皮石斛原球茎增殖和分化的影响 23

3.6光照时间铁皮石斛原球茎分化的影响 24

3.7不同培养基对铁皮石斛的生根培养的影响 24

结 论 26

致 谢 28

参考文献 29

1 文献综述

1.1 铁皮石斛生物学特征

铁皮石斛别称铁皮兰、黑节草，是兰科石斛属多年生附生草本植物，因其茎干呈铁绿色，故而得名铁皮石斛^[1][1]。铁皮石斛以其极高的药用价值久负盛名，具有祛痰、抗氧化、提高机体免疫功能、降血糖和抗癌等功效^[2][2]。目前市场上流通的石斛产品——铁皮枫斗，是经过加工处理后的铁皮石斛，是一味经济价值和药用价值极高的名贵中草药。

1.1.1形态特征

铁皮石斛是兰科石斛属多年生附生草本，具有气生根。茎直立丛生、高 30-50cm，肉质稍扁，具多节、有槽沟，呈黄绿色。单叶互生，叶片革质，无叶柄，叶形狭长，椭圆形或近披针形，叶鞘抱茎。总状花序腋生，每个花序有花 2～3 朵，白色，先端淡紫红色。蒴果，长圆形，有 4～6 棱。种子多而细小。茎丛生，直立，圆柱形，长9-35 cm，粗2-4 mm，不分枝，具多节，节间长1.3-1.7 cm，叶3-5枚，互生；叶二列，革质，长圆状披针形，绿色，稍带淡紫色，长2-5 cm，宽5-10 mm，先端急尖而略钩转，基部下延为抱茎的鞘，边缘和中肋带淡紫色，叶鞘多具紫斑，老时其上缘与茎松离而张开，并在节间留下1个环状铁青的间隙。总状花序，具2-3朵花；花序柄长5-10mm，基部2-3枚短鞘；花序轴回折弯曲，长2-4cm；花苞片干膜质，长5-7mm，卵形，浅白色，先端稍钝；花梗和子房长2-2.5cm；花瓣和萼片黄绿色，近相似，长约1.8 cm，宽4-5 mm，长圆状披针形，先端锐尖，具5条脉；侧萼片基部较宽，约1cm；萼囊圆锥形，长约5 mm，末端圆形；唇瓣白色，基部具1个绿色或黄色的胼胝体，卵状披针形，比萼片稍短，中部反折，先端急尖，不裂或不明显3裂，中部以下两侧紫红色条纹，边缘多少波状；唇盘密布细乳突状的毛，并且在中部以上具1个紫红色斑块；蕊柱黄绿色，长约3mm，先端两侧各具1个紫瓣；蕊柱足黄绿色带紫红色条纹，梳生毛；药帽白色，长卵状三角形，长约2.3mm，顶端近锐尖并且2裂。花期3-6月^[3][3]。果实为椭圆形硕果，长3-5cm，成熟时为黄绿色，每个果实含上万颗种子。种子极小，无胚乳。

1.1.2生境特点

野生的铁皮石斛通常附生在海拔100～3000米高度之间的树上或岩石上，喜温暖、湿润和半阴环境，不耐严寒^[4][4]。一般铁皮石斛的生长适温在18～30℃之间，但处于不同时期的石斛对温度的要求不同。夜间温度在10～13℃之间，10～15℃的温差为宜；白天温度超过30℃石斛的生长会受到影响，但影响不大；生长期温度 16～21℃比较合适，休眠期适温为 16～18℃；冬季温度不宜低于 10℃，否则幼苗容易受冻^[5][5]。铁皮石斛的生长环境忌干燥、怕积水，在新芽开始萌发至新根形成时需充足水分。但是过于潮湿的环境下，如果遭遇低温，很容易引起腐烂。天晴干热时，要及时浇水，同时还应该多向地面洒水，保持较高的空气湿度。在栽培上石斛比较喜光，一般以散射光为宜，光照环境保持夏秋遮光 50%、冬春遮光30%比较适宜^[6][6]。过强的光照条件下，茎部膨大、叶色黄绿。充足的光照条件下，不仅开花好，而且开花数量多。野生石斛对土肥要求不高，一般在疏松的树皮或树干上就可以生长，有的甚至在石缝中存活。铁皮石斛生境独特，对小气候要求严格。小气候中的水分是铁皮石斛生长的制约因素，尤其是空气中的湿度，致使铁皮石斛的地域分布有限^[7][7]。

1.1.3 地理分布

自然环境下生长的铁皮石斛通常分布于高海拔的热带、亚热带雨林以及温暖湿润的环境中，在树干及林下岩石上附生，湿度 70%左右，年均温在 12～18℃之间，在降雨量 1100～1500mm 的地区长势良好^[8][8]。石斛原产于中国、日本、菲律宾和澳大利亚等国，主要分布于亚洲热带至大洋洲地区，分布最丰富的地区是喜马拉雅的尼泊尔和锡金所在区域^[9][9]。全世界约有 1500 种，我国共有 76 个种，其中包括 2 个变种^[10][10]。 在我国，铁皮石斛的主要分布区域在秦岭和长江流域及其以南的 10 多个省区，即北纬 30°以南地区，在台湾省也有分布，海拔从 300m 到 3000m 区域都有分布。此外，北纬 30°～35°之间也有少量分布，这种分布呈现出由南向北种类逐渐减少的趋势^[11][11]。铁皮石斛主要产于安徽西南部(大别山)、浙江东部(鄞县、天台、仙居)、福建西部(宁化)、广西西北部(天峨)、四川、云南东南部石屏、文山、麻栗坡、西畴^[12][12]。中国西南地区的云南省是中国石斛属植物资源分布的第一大省。石斛资源主要分布在气候温暖湿润的德宏州、保山地区、文山州、红河州、思茅地区和西双版纳傣族自治州^[13][13]。

1.2 铁皮石斛快速繁殖研究

自然条件下，铁皮石斛因种子缺乏胚乳，繁殖能力极其低下，再加上人类长期无节制采掘，野生资源日趋枯竭，目前市场上流通的铁皮石斛，基本都是人工栽培品种，但其产量仍不能满足现今的药用需求^[14][14]。为了保护现有野生种质资源，保持铁皮石斛的种源稳定供应，对铁皮石斛组培快繁的研究日益增多^[15][15]。通过组织培养获得铁皮石斛再生植株的途径主要有：1.用成熟的种子消毒后进行无菌播种产生种苗或形成原球茎并增殖，进而分化发育成完整植株。2.诱导适宜外植体(茎段、茎尖、幼芽、叶片等)形成拟原球茎或丛生芽来实现快速繁殖，从而获得大量再生植株^[16][16]。其中，利用丛生芽繁殖是一种芽到芽的快繁途径，不需要通过诱导原球茎分化不定芽，能够稳定遗传母本的优良特性，继而减少后代发生变异的机率^[17][17]。

目前，对于石斛属植物的组织培养研究已经取得了一定进展，并逐步走向成熟。利用石斛的种子、茎段、叶、根等作外植体^[18][18]，诱导产生胚性愈伤组织并增殖^[19][19]，随后形成类胚组织原球茎，进而发育成完整的再生组培苗植株，均取得了成功^[20][20]，但由于铁皮石斛组培苗根系纤弱不发达，加上其对生态环境要求苛刻，移栽后成活率极低，因此移栽驯化技术成为今后组织培养将要研究的重要内容^[21][21]。

1.3 铁皮石斛次生代谢产物研究

自古以来，铁皮石斛就是我国名贵的中草药材，同时还有很高的观赏价值^[22][22]。野生铁皮石斛的药性功能位居石斛之首，主要在于石斛中富含的次生代谢产物，诸如多糖、生物碱、抗癌菲、类黄酮等次生代谢物质，使其具有极高的药用价值。铁皮石斛中含有的石斛碱、石斛多糖和石斛宁等物质，具有生津益胃、滋阴清热、抗衰老、提高人体免疫功能、抗肿瘤和扩张血管的作用^[23][23]。因此，在组织培养过程中对组培苗次生代谢产物的研究具有一定的意义^[24][24]，通过研究不同培养条件下有效成分的积累，为人工栽培高药用价值的石斛提供指导。