摘 要

：本研究利用扫描电镜对7个薄壳山核桃品种的花粉形态、外壁纹饰等进行了系统观察和比较分析，结果显示：（1）薄壳山核桃花粉大小中等，形状为扁球形或近圆形，花粉粒都具有3个萌发孔，均匀分布在赤道面上；（2）不同品种花粉表面均呈颗粒状纹饰，其中Jinhua花粉表面颗粒状突起最为密集，进化水平更高；（3）不同品种花粉在极轴长（P）、赤道轴长（E）以及PE比值上存在不同程度的差异性，薄壳山核桃种群间具有丰富的遗传多样性；（4）7个花粉赤道面观相同，但极面观却存在差异，Pawnee、Mahan、 Mohawk极面观呈三角形，而Nannong、Jinhua、Shaoxing、YL023呈圆形，表明它们亲缘关系较远。本试验表明，薄壳山核桃花粉体和萌发孔在种内的变异相对稳定，可作为该种分类的辅助孢粉指标。

关键字：薄壳山核桃；花粉形态；电镜扫描

Pollen morphological characteristics and classification research of pecan

Abstract: In this study, pollen morphology, wall ornamentation systematic of 7 pecan cultivars was observed by scanning electron microscopy. The results showed that: (1) Pecan pollen is medium in size, flat spherical or nearly round in shape, pollen pore has three holes, evenly distributed in the equatorial plane; (2) Pollen grains of different varieties all have graininess in their surface, of which ‘Jinhua’ is the most intensive, suggesting a higher level of evolution; (3) The polar length (P), equatorial axis length (E) and the PE ratio varies signally in different varieties , thus indicating pecan has a high genetic diversity; (4) Pollen gains of 7 pecan cultivars have the similar equatorial view, but polar view are different, ‘Pawnee’, ‘Mahan’, ‘Mohawk’ are triangular in polar view, while ‘Nannong’, ‘Jinhua’, ‘Shaoxing’, ‘YL023’ are rounded, indicating that they distantly related. The tests showed that the variation of pollen shape and pore are relatively stable as secondary pollen indicators for classification.

Keywords: Pecan (Carya illinoensis); Pollen morphology; Scanning electron microscope

目 录

1 前言 1

1.1 孢粉学机理及其研究意义 1

1.2 花粉电镜扫描技术进展 2

1.3 花粉超微结构比较研究进展 2

1.3.1 花粉形状和大小比较研究 2

1.3.2 花粉萌发器官比较研究 3

1.3.3 花粉外壁表面特征比较研究 3

2 试验研究方法 4

2.1试验地概况 4

2.2试验材料与方法 4

2.2.1样品的采集 4

2.3.2电镜扫描 5

2.3.3 统计分析 5

3 结果与分析 5

3.1 花粉的外部形态特征 5

3.2 花粉粒的大小比较 5

3.3 花粉粒的萌发孔及表面纹饰 8

4 结论与讨论 9

4.1 花粉形态特征与演化进化 9

4.2 花粉形态特征与遗传多样性 10

4.3 花粉形态特性与亲缘关系 10

致 谢 11

参考文献 12

1 前言

薄壳山核桃(Carya illinoensis)又名美国山核桃、长山核桃，胡桃科山核桃属，是典型的异花授粉植物。它原产北美东部，是世界上最重要的油料干果树种之一^{[1, 2]}。但目前国内外关于薄壳山核桃花粉形态特征却并无太多的报道。纵观前人对百合^[3]，杜鹃^[4]，银杏^[5]等其他物种的花粉形态进行的分类实验和报道，其主要是对花粉显微形态下花粉的大小，外部形态，表面纹饰等进行观察和比较研究。如通过对麝香系、亚洲系与东方系百合品种花粉的微观形态观察，发现麝香系百合的花粉浅黄色、花粉粒纺锤形、网脊带状,亚洲系百合花粉棕黄色或橙红色、花粉粒纺锤形、网脊瘤状,东方系百合的花粉黄色、花粉粒椭圆形、网脊盘珠状，将这些花粉微观形态资料采用多元统计分析方法研究其品种间的亲缘关系,从而将3个杂种系的品种得到了正确的归类。

薄壳山核桃引种至中国已有100多年，但至今仍未形成产业化发展^[6]。制约薄壳山核桃发展的重要因素之一是苗木繁殖技术不过关，而植物遗传育种又与花粉有着密切的关系，探讨花粉的特性是研究薄壳山核桃开花结果的主要内容之一，对提高薄壳山核桃产量和品质有着重要意义。同时，花粉形态独特，外壁结构复杂，纹饰细腻，带有大量品种演化信息，花粉形态特征和超微结构对植物的分类有很大的研究价值^[7-9]。因此，薄壳山核桃花粉形态研究可为薄壳山核桃品种分类及种植资源亲缘关系研究提供依据。

1.1 孢粉学机理及其研究意义

孢粉学是研究现代植物孢子花粉和地层中有机壁微体化石孢子花粉和其他孢型的形态分类及其应用的一门学科^[10]。关于植物进化在孢粉学上有许多不同的观点，有的甚至是完全相反的结论。对于花粉大小，WALKER^[11]认为花粉粒的大小在进化上是以从大到小而变化的，刘庚峰等^[12]则认为柑橘花粉的演变是体积由大到小，而李树林^[13] 等则认为枣花粉的演变在体积上无明显的大小顺序。对于花粉粒表面纹饰的变化，多数研究持同一观点，即植物的进化方向由表面纹饰从简单到细致复杂^[14-18]。之所以将花粉形态特征用于物种分类和演化的研究，正是由于其包含大量有关品种特征的遗传信息。花粉的形态特征是受植物基因控制的，不受外界条件的影响，其形态比较稳定。众多学者研究认为，花粉形态不仅稳定，而且是基因型的外部表现^{[14, 16-18]}。

1.2 花粉电镜扫描技术进展

自20世纪80年代后，扫描电子显微镜在花粉形态学研究中得到了广泛的应用，并成为观察研究的主要手段，并开始用透射电子显微镜研究花粉壁的结构^[10]。常见的电镜样品制备技术有粘台真空喷镀技术制备法、固定粘台真空喷镀技术制备法、组织导电技术制备法和临界点干燥技术制备法等。徐伯森^[19]等研究发现，壁薄、含水量大的杨树、苦竹的花粉外观形态和超微结构变化严重；壁稍厚、含水量较小的萱草花粉的外观形态基本保持良好，但超微结构收缩变形;壁较厚、含水量少的鹅掌楸花粉的外观形态和超微结构均保持良好状态。不同种类植物花粉的生物性能差别较大，样品制备方案应根据花粉的自身特性制定；对于壁薄、含水量大的花粉样品，在样品制备过程中必须进行固定并消除液体表面张力的影响，才能保持好花粉的外观形态和超微结构特征^[19]。

1.3 花粉超微结构比较研究进展

早期以光学显微镜为观察工具的研究对象主要是某些科、属的花粉形态的特征,由于电子显微镜的高分辨率和高清晰度的特点,人们可以对某一属的不同种之间、不同的栽培品种间乃至不同植株个体间的花粉形态差异开展深入的研究。

1.3.1 花粉形状和大小比较研究

花粉形态特征是研究植物起源，演化及亲缘关系的重要依据。在刘剑锋^[12]等研究发现5种秋子梨品种的花粉形态都较为单一，主要为长萌发沟，多呈橄榄形，极面观为3劣三角形或方形，不同品种花粉粒的饱满程度存在差异。王文莉^[20]等研究发现24个玫瑰品种花粉花粉形态均层长方形，赤道面观椭圆形，具三孔沟，以等间距环状分布，但品种间花粉大小有差别，如“香刺果”的花粉粒最大，“粉芙蓉”最小，相差近一倍，多数品种花粉粒大小为21.70×12.71μm~28.58×16.42μm。芦建国^[21]等对蜡梅3个品种群共21个品种的花粉粒形态特征进行了观察和比较，结果表明蜡梅花粉粒为中等大小，近扁球形至圆球形，蜡梅品种间花粉形态比较类似花粉形态与内被片和中被片颜色并无直接关联。因此，仅仅依靠花粉形态很难对品种进行分类和鉴定，只有综合运用形态学、孢粉学、细胞解剖学、分子生物学等手段，才能得到科学的结论^[21]。

1.3.2 花粉萌发器官比较研究

萌发孔是指花粉外壁上的薄壁区域所形成的开口。此种开口的长轴通常为短轴的二倍或更小。花粉萌发时,花粉内壁从萌发孔向外突出,形成花粉管。萌发孔的形状、结构、数目和大小随植物种类不同而异,是鉴别植物的依据。枣^[22]品种花粉的发芽器官是萌发沟，正常的花粉粒有3条萌发沟，属三孔沟类型。6个枣品种萌发沟很相似，它们的细微差别为：带状，平直；萌发沟狭缝状，中央部扩大；沟两端扩大。云杉^[23]萌发区位于花粉体远极薄壁区中部两气囊之间，萌发沟处于萌发隔膜内部呈现或深或浅的沟痕，远极面观萌发沟的形态有两种。桑^[24]品种花粉的发芽器官是萌发孔，不同种质花粉萌发孔凹陷程度存在差异，‘昂绿l号’、‘Clafat’花粉萌发孔内陷程度较小，而‘晋选7号’和‘86203’内陷程度较深。

1.3.3 花粉外壁表面特征比较研究

在对花粉形态的观察中，花粉壁纹饰毫无疑问是一个重要的分类指标。花粉外壁纹饰不易受环境因子的影响，为植物基因型的外部表现，所以是研究植物分类演化的有效手段之一。方从兵^[25]等对梅品种花粉壁超微结构比较研究指出花粉的形态特征主要反映在花粉壁纹饰和划分表面雕纹两个方面，另外还包括花粉的大小，形状和萌发器官特征等方面。对于梅而言，同一花粉壁纹饰特征的品种间亲缘关系更近，不同纹饰类型间亲缘关系较远。张俊娥^[22]等通过对6个枣品种花粉形态的观察，表明枣花粉形状、大小和外壁纹饰的异同，可反映出其品种间的亲缘关系和进化过程。亲缘关系越相近的种质，花粉形态越相似。刘剑锋^[12]等对5种秋子梨品种的花粉形态观察，得出5种秋子梨品种的花粉粒外形大致相同，花粉壁表面纹饰则存在较大差异，主要表现为网脊的粗细及其交叉或排列的程度不同。李建军^[26]等对怀地黄不同主栽品种花粉形态比较中，根据花粉粒网眼密度，将8个样品分为高密，中密和低密度3种类型。指出网眼的密度可以作为划分地黄品种的依据之一。在周兰英等^[27]对26种杜鹃属植物花粉形态及分类学研究中，通过对3亚属间外壁纹饰的观察，由于其未表现出有规律的变化，单粒花粉形状、外壁颗粒大小及形态、裂纹有无、四合体间缝深浅、粘丝多少、 萌发孔有无内含物及内含物形态等在各亚属间部分重迭交叉与亚属没有直接联系。因此，外壁纹饰不宜作为亚属划分的依据。蔡秀珍等^[28]对凤仙花属部分植物的花粉形态中指出，网脊宽，网眼大小和网眼内突起在不同物种中有一定差异。如缅甸凤仙花的网脊弯曲，轿细，网眼内几无颗粒状突起；铜壁关凤仙花网脊较直，网眼内颗粒状突起较少；杏黄凤仙花的网脊较直，网眼较小，网眼内不规则突起致密，有些呈颗粒状，有些则2~3粒呈念珠状或棒状。这些显著差异表明凤仙花属花粉的大小，形态及外壁纹饰，特别是网脊，网眼内附属物等特征可能具有更为重要的分类学价值，应被视为分类研究的主要特征之一。

薄壳山核桃作为被子植物，其必然拥有被子植物的典型特征—柱状层。柱状层的进化趋势是从无定形到颗粒状再发育生成柱状，外壁内层在原始被子植物中缺乏。柑橘属花粉外壁内层明显，栽培品种花粉外壁结构较进化类型较古老的野生柑橘花粉外壁柱状呈颗粒结构，而较进化的栽培柑橘花粉外壁柱状层呈小柱状结构，柑橘粉外壁柱状进化趋势是由颗粒状到小柱状^[29]。由此可见，花粉外壁柱状层结构也可以作为研究被子植物进化，分类的一个指标。

2 试验研究方法

2.1试验地概况

试验在南京绿宙薄壳山核桃科技有限公司六合试验基地进行，地处南京市六合区雄州镇山北村，纬度31°14′~32°37′，经度118°22′~119°14′，海拔170m左右，年均气温15.1℃，1月平均气温1.7℃，7月平均气温27.6℃，极端低温﹣16.3℃，极端高温39.4℃，无霜期239天，≥10℃的年积温4820℃，年均降水量1004.4 mm，其中7月最多，平均降水量190.9 mm，最少月为12月，平均降水量22.4 mm。

2.2试验材料与方法

2.2.1样品的采集

供试的7个品种，均为7年生嫁接苗，树体健壮，花期稳定。在薄壳山核桃雄花花药变黄时，采集雄花花序置于硫酸纸上自然晾干。待花药散粉，用120目药典筛筛出花粉并经干燥处理保存备用。