摘 要

在突然升温和其他应激的条件下，一切生物细胞包括原核细胞及真核细胞都合成了一系列蛋白质，这些蛋白质称为热休克蛋白(heat shock protein，HSP)。近年来研究发现，一些HSP家族成员在肿瘤细胞中表达增强并参与肿瘤细胞的某些生物活动。在本研究中我们重点研究了HSP40和HSP70在肿瘤治疗中的作用。研究成果如下：

（1）首先构建HSP40-PRK5-Flag过表达质粒并设计psiuPAR-U6.1和psi-MRJ-U6.1干扰质粒。随后对HEK293细胞进行培养并将构建的干扰质粒进行转染。最后利用Western blotting检验其蛋白水平表达。结果表明，其能有效的抑制uPAR，HSP40的表达。

（2）采用免疫共沉淀实验。首先，用内源以及外源的Co-IP验证uPAR与HSP70的确存在相互作用。再分别用HA抗体进行共沉淀，Flag抗体检测，能检测到HSP40，HSP70这两个条带，这说明uPAR，MRJ，HSP70可能是作为一个复合体存在。随后用HSP40干扰质粒干扰HSP40表达后在uPAR-HA，及HSP70共转的情况下验证两者的相互作用。证明HSP40能对uPAR与HSP70之间的相互作用产生影响。

（3）最终进行Transwell实验。将转染psiHSP70，psiHSP40的细胞铺入Transwell小室中，24h后固定，染色观察同时将染色后的细胞进行染液抽提定量分析，发现共转染后能显著抑制肿瘤迁移。同样又进行了细胞划痕实验，将加入干扰质粒和没有加入干扰质粒的细胞在体外培养，并划痕致伤。结果表明，加入干扰质粒的293细胞迁移能力明显受到抑制。

关键词：热休克蛋白 肿瘤迁移 Western blotting

Abstract

HSPs are a protein family that can be induced by environment stresses, especially sudden temperature rise. Recently, the relationship between enhanced expression of HSP and cancer has been well established. In this study, we investigated the significance of HSP70 and HSP27 in cancer therapy. The following are the results:

(1) Firstly, RNA interference plasmids of HSP40 and HSP70 were constructed and then transfect into HEK293 cells. We then performed western blotting to examine the expression of the protein level. The results show that the expression of uPAR and HSP40 can be effectively suppressed by RNA interference plasmids of HSP40 and HSP70.

(2) Then, we choose endogenous and exogenous to use Co-IP to prove that uPAR and HSP70 do have interrelated. After that HA antibody and Flag antibody were tested by Co-IP. The detection of two bands of HSP40 and HSP70 explains that Upar，MRJ，HSP70 may exist as a composite body. What’s more, we interfere HSP40 with the interference plasmid of HSP40 and verify the interaction between the two which further proves that HSP40 have an impact on the interaction between Upar and HSP70.

(3) Thirdly, we put the transfected psiHSP70 and psiHSP40 into the Transwell Chamber. After 24 hours, we stained the cells and do quantitative analysis of dye extraction. We found that co-transfection significantly inhibited tumor migration. Finally, we do some wound healing experiments. We cultivated the cells which add to interference plasmid and not a member of the interference in vitro and injuried the cells by scratches. The results show that the migration of 293 cells which add the interference plasmid was significantly inhibited.

Key words: heat shock proteins; tumor migration; western blotting

目录

前言……………………………………………………………………………………………….6

1． HSP蛋白家族简介……………………………………………………………………6

1.1 HSPs的分类及结构特点………………………………………………………6

1.2 HSPs的生物学功能……………………………………………………………8

1.2.1 HSPs的主要功能 ………………………………………………………8

1.2.2 HSPs的作用所具有的特点 …………………………………………8

1.3 HSPs的作用机制 ………………………………………………………………8

2．HSPs与肿瘤的关系 …………………………………………………………………8

2.1 HSPs与肿瘤的发生及转移……………………………………………………8

2.2 HSPs与肿瘤细胞凋亡…………………………………………………………9

2.3 HSPs与肿瘤免疫 ………………………………………………………………10

2.4 HSPs与肿瘤耐药性 ……………………………………………………………10

2.5 HSPs在肿瘤中的表达及意义…………………………………………………11

3．HSP作为靶点与肿瘤的治疗…………………………………………………………12

4. 研究意义…………………………………………………………………………………12

实验部分………………………………………………………………………………………14

1.实验材料和方法 ……………………………………………………………………14

1.1 药品试剂与质粒 ……………………………………………………………14

1.2 构建质粒………………………………………………………………………14

1.2.1 构建uPAR-PCI-HA，HSP40-PRK5-Flag过表达质粒 …………14

1.2.2 构建psiuPAR-U6.1，psi-MRJ-U6.1干扰质粒…………………14

1.2.3 细胞培养及转染 ……………………………………………………15

1.2.4 免疫共沉淀( C0-IP) 试验 ………………………………………15

1.2.5 Western blotting …………………………………………………16

1.2.6 PCR 检测基因的表达水平…………………………………………16

1.2.6.1 RNA 的提取……………………………………………………16

1.2.6.2 RNA逆转录 ……………………………………………………16

1.2.6.3 PCR检测 ………………………………………………………16

1.2.7 Transwell 内皮细胞的体外迁移实验 …………………………17

1.2.8 Wound healing细胞划痕实验 ……………………………………17

2. 实验结果与讨论 ……………………………………………………………………18

2.1 干扰质粒及片段的构建……………………………………………………18

2.2 构建的干扰质粒有效抑制uPAR、HSP40在蛋白水平上的表达……19

2.3 免疫共沉淀确定uPAR，HSP40，HSP70三者之间的相互作用………20

2.4 HSP40、HSP70与uPAR蛋白、mRNA表达量的关系……………………21

2.5 HSP40干扰表达后抑制肿瘤细胞迁移……………………………………22

2.6 Wound healing细胞划痕实验证明HSP40干扰表达后抑制肿瘤迁移

…………………………………………………………………………………23

讨论 ……………………………………………………………………………………………25

致谢 ……………………………………………………………………………………………26

参考文献………………………………………………………………………………………27

前言

1.HSP蛋白家族简介

在突然升温和其他应激的条件下，一切生物细胞包括原核细胞及真核细胞都合成了一系列蛋白质，这些蛋白质称为热休克蛋白(heat shock protein，HSP)，又称为应激蛋白。HSPs的研究可以追溯到1935年，人们发现加热果蝇蛹可诱导发育缺陷。进一步研究发现，除环境热因素外，缺氧、重金属、乙醇及感染等100多种理化因素可诱导机体产生HSPs。HSPs在细胞生长、发育、分化、基因转录等功能方面发挥重要的作用，其主要的生物学功能是在应激状态下保护细胞生命活动必需的蛋白质，维持细胞生存^[1]。

HSP表达的改变不仅可能是细胞老化的因素，而且还可以作为判断细胞生理状态和应激能力的指标。近年来的研究表明HSP还参与某些病毒蛋白的成熟。在肿瘤细胞中，一些HSP家族成员表达增强并参与肿瘤细胞的某些生物活动。在此我们介绍其中较突出的几个内容。