摘 要

杨树不仅是一个重要绿化树种，也是重要的速生丰产树种。本研究在实验室已建立的南林895杨（Populus×euramericana cv.‘Nanlin895’）叶盘外植体高频再生系统的基础上，采用农杆菌介导法，将大豆氯离子通道蛋白基因GmCLC1转化到南林895杨中，用卡那霉素选择培养基筛选长出不定芽及生根的转基因外植体，结果获得了抗性转化植株。PCR检测显示，南林895杨基因组中已含GmCLC1基因片段。耐盐试验研究表明，转基因895杨与对照未转基因895杨在相同盐浓度处理下，转基因植株表现出较强的抗盐能力。对转基因植株抗逆性相关的生理生化指标检测，如：叶绿素含量、叶片丙二醛（MDA）含量、过氧化物酶（POD）活性、超氧物歧化酶（SOD）活性等，结果为转GmCLC1基因植株耐盐性比对照植株有显著提高，为选育杨树抗盐新品种提供了实验基础。

关键词：农杆菌，GmCLC1基因，遗传转化，耐盐性

Abstract

Poplar tree was one of important fast-growing timber and green species.In the study, our laboratory has been established Nanlin 895 poplar tree(Populus × euramericana cv.The 'Nanlin895')leaf explants high frequency regeneration system,which based on GmCLC1 gene from soybean was introduced into nanlin 895 poplar tree by Agrobacterium tumefaciens mediated transformation.GmCLC1 was a soybean chloride channel protein gene.We have get transformed plants which resistanced kanamycin inducing adventitious buds and rooting.PCR analysis showed that the GmCLC1 gene was successfully integrated into the nanlin 895 poplar tree genome. Salt tolerance experiment showed that transgenic plants could better stand salt than non-transgenic plants under the same salt concentration.The.physiological detection of transgenic 895 poplar tree,chlorophyll content,leaf malondialdehyde(MDA),peroxidase (POD) activity and superoxide dismutase (SOD) activity,evidenced that GmCLC1 gene expressed in 895 Poplar tree helped to enhance the salt tolerance of poplar tree according to the comparison of transgenic plants with the control group, it has provided the experimental basisfor breeding new varieties of tolerance salt poplar tree.

Key words: Agrobacterium tumefaciens; GmCLC1 gene; Genetic transformation; salt-tolerance

目 录

前 言 1

正 文 2

1文献综述 2

1.1杨树转基因的研究概况 2

1.1.1杨树的生物学特征 2

1.1.2杨树的分布及用途 2

1.1.3杨树的基因工程研究进展 2

1.2盐胁迫对植物的影响 3

1.2.1对种子萌发的影响 3

1.2.2对植物新陈代谢的影响 3

1.2.3对植物形态的影响 3

1.3抗盐GmCLC1基因研究概况 4

1.4农杆菌介导的遗传转化原理 4

1.5转基因杨树的筛选与检测 4

1.5.1标记基因 4

1.5.2 PCR检测 5

1.6本研究的目的及意义 5

2大豆GmCLC1基因对895杨的遗传转化 6

2.1实验材料 6

2.1.1植物材料 6

2.1.2质粒和菌株 6

2.1.3酶和试剂 6

2.1.4常用培养基 6

2.2实验方法 6

2.2.1农杆菌感受态细胞的制备 6

2.2.2液氮冻融法转化农杆菌 7

2.2.3叶盘法转化895杨 7

2.2.4植株的PCR检测 8

2.2.5转基因植株的耐盐性检测 9

2.3结果和分析 9

2.3.1转化和筛选 9

2.3.2抗性植株的PCR检测 9

2.3.3转基因植株的耐盐性检测 10

3盐胁迫下转基因植株组培苗的生理生化指标分析 11

3.1实验材料 11

3.1.1植物材料 11

3.2实验方法 11

3.2.1生物生化各项指标的测定 11

3.3结果与分析 13

3.3.1叶片叶绿素含量测定 13

3.3.2过氧化物酶（POD）活性测定 14

3.3.3超氧物歧化酶（SOD）活性测定 15

3.3.4叶片丙二醛（MDA）含量测定 15

结 论 17

1转基因植株分子检测 17

2转基因植株的抗逆性实验 17

3转基因植株的生理检测实验 17

讨 论 18

1农杆菌介导的895杨树遗传转化 18

2 GmCLC1基因在南林895杨耐盐能力中的作用 18

致 谢 19

参考文献 20

前 言

利用基因工程手段，将抗逆基因转入目的树种，以提高作物的抗逆性，已经成为提高林木抗逆性状的一个重要途径。杨树（Populus）是一个栽培历史悠久、种类繁多、分布广泛的重要绿化树种，也是重要的能源、纸浆、胶合板等用材树种之一。我校选育出的南林895杨树主要适宜在黄淮平原、江淮平原及长江中下游平原地生长，对于盐碱地适应性不高，然而通过常规方法选育优良林木品种，因生长周期长，所以耗时也长，所以可以利用基因工程手段，向目的树种转入抗盐、抗旱基因，短时间内即可检测耐盐、抗旱性，获得转基因植株，最终扩大生产应用。

南林895杨是南方型黑杨派系速生杨，为南京林业大学“九五”科技攻关时选育出的杨树单板用材品种，具有速生、优质、高产等特点，2000年通过国家林业局组织的专家鉴定；2001年获得国家四部委优秀科技成果奖；2002年通过国家林木良种审定，是我国“十五”期间培育出的杨树新品种，并重点推广。