摘 要

本实验首先研究了反应体系pH值、反应温度和反应时间这三个因素对美洲黑杨多酚氧化酶（PPO）活性测定的影响。结果表明测定杨树PPO的最适条件为：pH值为4.0，温度为25℃，时间为1min。其次，利用实验得到的反应最适条件进一步研究了阿维菌素对杨树PPO活性的影响。结果表明用100和200mg/L阿维菌素处理杨树24h、48h和72h，其PPO活性没有影响；用400mg/L阿维菌素处理杨树48h ，其PPO活性增强，24h和72h没有影响；用800mg/L阿维菌素处理杨树48h和72h，其PPO活性均增强，24h没有影响。

关键词：美洲黑杨；阿维菌素；多酚氧化酶；最适反应条件；比活力

The effect on polyphenol oxidase by abamectin in poplar

Abstract: The optimal conditions of assaying polyphenol oxidase (PPO) activity from poplar were detemined. The results showed that the optimal pH value was 4.0, and the optimum temperature of PPO was 25℃, and the optimum reaction time was 1 minute for PPO in poplar. Furthermore, the effect on PPO by abamectin in poplar was studied. The results showed that PPO activity was the same to the control after being treated by 100 or 200 mg/L abamectin for 24h, 48 or 72h. In addition, PPO activity was induced after being treated by 400 mg/mL abamectin for 48h, while PPO activity wasn’t different to the control for 24 or 72h. Furthermore, PPO activity was induced after being treated by 800 mg/mL abamectin for 48 or 72h, while PPO activity wasn’t different to the control for 24h.

Key words：poplar; abamectin; polyphenol oxidase; optimum reaction condition; specific activity

目 录

1前言 1

1.1 多酚氧化酶（PPO） 1

1.2 PPO在自然界的分布 1

1.3 PPO基因的克隆与表达 2

1.4 多酚氧化酶PPO的结构特性 2

1.5 PPO的生理功能 3

1.6 多酚氧化酶的提取方法及活性测定 3

1.7 多酚氧化酶的应用 4

1.8 展望 4

2实验材料与方法 5

2.1 供试苗木 5

2.2 供试化学试剂 5

2.3 杨树处理 5

2.4 酶液的制备 5

2.5 pH值对杨树PPO活性的影响 5

2.6 温度对杨树PPO活性的影响 6

2.7 反应时间对杨树PPO活性的影响 6

2.8 不同处理的杨树PPO活性的测定 6

2.9 蛋白含量的测定 6

2.10数据分析 6

3.结果与分析 7

3.1 杨树PPO最适反应条件的确定 7

3.1.1 pH值对杨树PPO活性的影响 7

3.1.2温度对杨树PPO活性的影响 7

3.1.3 反应时间对杨树PPO活性的影响 8

3.2阿维菌素对杨树PPO活性的影响 8

4.讨论 10

致谢 11

参考文献 12

1前言

1.1 多酚氧化酶（PPO）

多酚氧化酶（Polyphenol Oxidase，简称PPO）属核编码含铜金属酶，是自然界分布极广、植物体内普遍存在的一类氧化还原酶，在氧气存在的条件下催化各种酚类（如儿茶酚，黄酮等）使之氧化成醌，醌类再进一步氧化合成黑色素^[1]，它是引起酶促褐变的主要酶类。自1883年Yoghid发现日本漆树液汁变硬可能和某种活性物质相关，1938年KeilinD.和MannG.研究了蘑菇多酚氧化酶的提取和纯化，得到多酚氧化酶并将这类酶称为Polyphenoloxidase^[2]。之后多酚氧化酶一直是研究的热点，尤其是在PPO的生化、生理学性质方面取得了较大的进展^[3]。

1.2 PPO在自然界的分布

PPO是核编码的的铜金属酶，是在细胞质中合成的，普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中，PPO相当稳定，甚至在土壤中已腐烂的的植物残渣上都可检测到PPO的活性。在植物（如土豆、苹果、荔枝、菠菜、马铃薯、豆类、茶叶、烟草等）组织中，PPO是与内囊体膜结合在一起的，天然状态无活性，但将组织匀浆或损伤后酶活被活化，从而表现出活性，在果蔬细胞组织中，PPO存在的位置因原料的种类、品种及成熟度的不同而有差异，绿叶中PPO活性大部分存在于叶绿体内^[4]；马铃薯块茎中几乎所有的亚细胞部分都含有PPO，含量大约与蛋白质部分相同^[5]，马铃薯芽、根的多酚氧化酶的活性最高，幼叶和成熟块茎中活性中等，成熟叶和茎叶活性最低；在茶叶中的PPO可分为游离态和束缚态，前者主要存在于细胞液中属可溶态PPO，而后者则主要存在于叶绿体、线粒体等细胞器中，与这些细胞器的膜系统或其他特异部位结合呈不溶态^[6]。在采摘的鲜苹果中，PPO几乎存在叶绿体和线粒体中。刘乾刚认为，PPO在细胞内除了存在于叶绿体及线粒体上外，细胞壁也可能存在PPO，且对发酵产生影响，细胞只要轻微破损便有PPO的作用。在动物中(如鼠、兔)，PPO也得到了分离。

1.3 PPO基因的克隆与表达

近十几年来, 随着生物化学和分子生物学的迅猛发展, 尤其是酶纯化技术、免疫技术、PCR 技术、反义RNA 技术等的成功应用, 番茄、马铃薯、甘薯、菠菜、美州商陆、葡萄、菠萝、苹果、梨、桃、日本枇杷、中国木瓜、荔枝、茶树等园艺植物的PPO基因已被克隆^[7]。多酚氧化酶基因属于一个多基因家族, 番茄中至少有6个多酚氧化酶基因,而苹果中至少有4个多酚氧化酶基因。Rathjen AH等研究表明, 不同植物、同一植物的不同组织器官、统一组织器官的不同发育时期多酚氧化酶基因的表达量均不相同。马铃薯的根和靠近茎端的叶和叶柄以及完全开放的花都有多酚氧化酶基因的表达, 而低于3个叶节下面的叶中探测不到多酚氧化酶mRNA的存在；开花1周至20周后的苹果中都有多酚氧化酶mRNA的出现；而葡萄的多酚氧化酶mRNA 的表达要早得多, 并随着果实的成熟其表达量逐渐稳定在一个比较低的水平。植物组织受伤后多酚氧化酶mRNA的表达量增加。冷害也可导致植物组织多酚氧化酶mRNA的表达量增加。这些结果表明, 在多酚氧化酶系统中存在着mRNA水平上的转录或转录后调控。Christian 等人利用反义RNA技术成功地使多酚氧化酶基因在马铃薯中进行反义表达, 专一和有效地抑制了马铃薯块茎的酶促褐变^[8]。

1.4 多酚氧化酶PPO的结构特性

PPO是一种含有Cu² 离子的结构蛋白，可以催化酚类上的羟基，使之转化为醌或催化多酚类变为氧合醌^[9]。因为醌类具有较强的电化学性质，会发生自动氧化、蛋白质的亲核聚合反应及一些二级反应，而这些反应都会导致酶促褐变反应的发生。植物中的PPO包括一些由核编码的，多基因的家族^[10]。在蕃茄中，已有几个PPO 的基因被分离出来，并从结构上将其分为三组。在马铃薯中，有4条独立的cDNA被克隆，每一个都显示了独特的空间图景。在扁豆中，有三条与PPO 有关的cDNA 克隆已被建立。所有的PPO基因都有两个区域，一是与Cu有关的编码区，另一个是引导肽（transitpeptide），以便能进入质体。PPO的前体（含有引导肽的）约60-75KDa，而成熟的PPO（去除了引导肽的有活性的形式）约45-69 KDa，由于这种潜在的酶活性的存在，使PPO活性的问题研究起来十分复杂。未激活的PPO 可被陈化作用、加盐、去污剂（如SDS）、蛋白酶切或尿素的加入等激活^[11]。

1.5 PPO的生理功能

高等植物组织发生褐变主要是PPO活动的结果。PPO催化单酚羟基化为邻二酚，二羟酚氧化为邻醌。醌聚合并与细胞内蛋白质的氨基酸反应，结果发生黑色或褐色色素沉淀，最终导致水果、蔬菜等经济作物营养丢失和经济损失^[12]。PPO作为一种氧化还原酶还在光合作用中发挥作用。如调节叶绿体中有害的光氧化反应速度，参与其中电子传递；PPO还可促进伤口的愈合，也可增加植物对病原体的抗性。如烟草对炭疽病、黄瓜对黑星病、苹果对轮纹病、棉苗对枯萎病菌、水稻对白叶枯病菌和细菌性条斑病以及番茄对小昆虫的抗性等。PPO的作用方式有：

1．如番茄的具腺毛状体中含有大量PPO，PPO具有存在于表皮中、活化态和可溶性的特性，在毛状体介导的抗病过程中起作用。