摘 要

杨树是重要的经济用材树种之一，常采用硬枝扦插的方式进行无性繁殖，然而扦插生根难易程度直接影响造林成活率，因此生根性状在其遗传改良研究中占有极为重要的地位。

长期以来，杨树遗传改良研究更多的是集中在地上部分，而对根系发育性状的认识和了解比较缺乏。为此，本研究从毛果杨（Populus trichocarpa）POPTR_0001s22120.1基因预测模型入手，以南林895杨为研究材料，克隆生根相关基因WOX11，以期望能够进一步了解杨树插穗生根的分子生物学原理，并应用于具体实践。

主要研究结果如下：

1. 本研究采用CTAB法提取南林895杨根的RNA。结果显示，CTAB法能获得较高质量的RNA，并且浓度较高，未发生弥散。
2. 通过RACE方法从南林895杨根的cDNA中克隆到了WOX11基因的全长cDNA序列。
3. 利用NCBI的同源比对，以及利用Bioedit软件进行的多重比对，证实我们所克隆到的是WOX11基因。

关键词：南林895杨；WOX11；同源克隆

Abstract

Poplar is an important timber species. Hardwood cutting is often used in polar propagation. Plant survival rate directly is affectted by rooting ability of cuttings. Thus rooting ability of cuttings plays a very important role in the poplar genetic improvement.

Over the years, more reaserches are focused plants’aerial parts, while the root development is lack of awareness and understanding. Based on POPTR-0001s22120.1 gene prediction model of Populus trichocarpa, we cloned WOX11 which is intertly realted with poplar rooting from P. deltoides, NL895, to look forward further understanding of poplar rooting molecular mechanism.

The main results are as follows:
1. Poplar NL895 root total RNA was extrated using CTAB method.The results showed that CTAB method can obtain high quality and quantity total RNA, without any dispersion.
2. By RACE method, we cloned a full-length cDNA sequence of WOX11 from poplar NL895.
3. NCBI homology comparison and Bioedit multiple comparison proved that we had obtained WOX11.

Key Words：poplar NL895 ；WOX11； Homology cloning

目录

前言 1

1.文献综述 1

1.1植物不定根发生 1

1.1.1植物不定根的概念 1

1.1.2不定根发生机理研究 1

1.1.3不定根发生分子调控机制研究 1

1.1.4 在不定根发生起始阶段的特异表达基因 2

1.2 WOX11基因在水稻不定根发生中的作用 2

1.3 WOX11在刺激根冠分生组织细胞分裂中起作用 2

1.4 WOX11在生长素与细胞分裂素信号传导促进根冠发育中的功能 3

1.5 WOX基因的在植物发育中功能 3

1.6本论文的研究目的 4

2.材料与方法 4

2.1材料准备 4

2.1.1 植物材料 4

2.1.2 菌株与载体 4

2.1.3 试剂、缓冲液 4

2.1.4 仪器与设备 5

2.2实验方法 5

2.2.1 RNA的提取与纯化 6

2.2.1.1 CTAB法提取植物RNA 6

2.2.1.2 DNA酶处理纯化RNA 6

2.2.1.3 总RNA的定量与完整性检测 6

2.2.2 WOX11基因的同源克隆 6

2.2.2.1 引物设计 7

2.2.2.2 第一链cDNA的合成 7

2.2.2.3 RT-PCR扩增 7

2.2.2.4 目的片段凝胶回收与纯化 7

2.2.2.5纯化片段与克隆载体的连接反应 8

2.2.2.6大肠杆菌感受态细胞的制备与转化 8

2.2.2.6.1 大肠杆菌活化 8

2.2.2.6.2 感受态细胞的制备 8

2.2.2.6.3 连接产物的转化 8

2.2.2.7 阳性克隆筛选及测序分析 9

2.2.3 WOX11基因的RACE扩增 9

2.2.3.1 引物设计 9

2.2.3.2 3’RACE套式PCR 9

2.2.3.2.1 3’RACE反转录 9

2.2.3.2.2 3’RACE Outer PCR 10

2.2.3.2.3 3’RACE Inner PCR 10

2.2.3.3 5’RACE套式PCR 11

2.2.3.3.1 去磷酸化处理 11

2.2.3.3.2 “去帽子”反应 11

2.2.3.3.3 5’RACE Adaptor连接 11

2.2.3.3.4 反转录反应 12

2.2.3.3.5 5’RACE Outer PCR反应 12

2.2.3.3.6 5’RACE Inner PCR反应 13

2.2.4 WOX11基因全长序列的获得 13

2.2.5 WOX11序列分析 13

3.结果与分析 14

3.1 南林895杨WOX11基因的克隆 14

3.2 南林895杨WOX11基因序列分析 15

3.3 WOX11基因的同源性分析 17

3.4系统进化树 18

4.讨论 19

致谢 21

参考文献 22

前言

根是植物长期适应陆地生境而形成的一个重要器官，是土壤与植物地上部分之间物质交换的桥梁，是植物繁荣和抵抗逆境的基础。根据发生方式的不同，根可分为胚生根和不定根。基因WOXll是一个可以控制不定根生长发育的关键调节因子，可通过介导植物生长素和细胞分裂素的信号传导来调控不定根的生长发育。

杨树是植物生物学研究的模式物种，其基因全序列已被测定。本研究从杨树中克隆WOX11基因，并进行特性分析。由于根在植物器官发育的研究中是一个非常理想的模式器官。该基因得分离将为分子育种提供了重要的理论依据和基因资源，将使人们对植物根的功能有更新的认识。

1.文献综述

1.1植物不定根发生

1.1.1植物不定根的概念