脂肽类化合物surfactin合成调控的机理研究毕业论文

 2021-04-12 11:04

摘 要

植物病害是影响农业生产的主要因素之一,也是一直令人担忧,需要不断研究加以解决的重要农业问题,然而,目前世界各国对植物病害的防治和解决办法主要是使用化学药剂,但长期施用化学农药会造成水土流失、土壤肥力下降、生态环境污染等严重问题。因此,相较于化学药剂,世界各国更倾向于使用微生物化肥、农药来进行植物病害的生物防治。目前,应用较多的生防细菌主要有芽孢杆菌(Bacillus)、假单孢杆菌、土壤放射杆菌等菌种。芽孢杆菌由于具有生长速度快、营养简单以及产生耐热、抗逆的芽孢等突出优点,现已成为一类理想的生防细菌。通过基因工程进行改良,提高抗菌物质的表达、诱导抗性,以加强其抗菌活性来增强生防效果,是当前生防芽孢杆菌研究的一个重要方向。本文利用一株遗传背景清晰的瓦雷兹芽孢杆菌(Bacillus velezensis)FZB42为原材料,从其突变体文库中选出两株脂肽类化合物合成突变株,初步分析其表面张力的变化,结果表明突变株表面张力的变化与Surfactin有关但并不是造成表面张力变化的主要原因。通过平板拮抗细菌和真菌,观察抑菌圈的大小的变化发现这两株突变株均能对巨大芽孢杆菌(Bacillus megatherium)类细菌和腐皮镰刀菌(Fusarium solani)、啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)类真菌产生明显拮抗作用,其中对巨大芽孢杆菌的拮抗作用明显增强。最终确定这两株突变株能够影响Bacillomycin D的合成。

关键词:FZB42;Surfactin;拮抗;表面张力

Antagonistic features of two Bacillus velezensis mutants defected in surfactant synthesis

ABSTRACT

Plant diseases are one of the main factors affecting agricultural production. They are also important agricultural problems that have been worrying and need to be continuously studied and solved. However, the prevention and treatment of plant diseases in countries around the world mainly use chemical agents, but long-term applications. Chemical pesticides can cause serious problems such as soil erosion, soil fertility decline, and ecological environment pollution. Therefore, compared with chemical agents, countries around the world are more inclined to use microbial fertilizers and pesticides for biological control of plant diseases. At present, most of the biocontrol bacteria used are Bacillus, Pseudomonas, and Soil radiobacteria. Bacillus has become an ideal biocontrol bacteria because of its outstanding growth rate, simple nutrition and the emergence of heat-resistant and stress-resistant spores. It is an important direction of the current research on Bacillus licheniformis by genetic engineering to improve the expression of antibacterial substances and induce resistance to enhance its antibacterial activity to enhance the biocontrol effect. In this paper, a strain of Bacillus velezensis FZB42 with a clear genetic background was used as the raw material, and two mutants of lipopeptide compound were selected from the mutant library. The surface tension was analyzed and the results showed that the mutation The change in surface tension of the strain is related to Surfactin but is not the main cause of the change in surface tension. By antagonizing bacteria and fungi on the plate and observing the change of the size of the inhibition zone, it was found that both mutants can be used against Bacillus megaterium and Fusarium solani and Saccharomyces cerevisiae. The fungus produced significant antagonism, and the antagonism of Bacillus megaterium was significantly enhanced. It was finally determined that these two mutant strains could affect the synthesis of bacillomycin D.

Key words:FZB42 ; Surfactin;Antagonism ; Surface tension

目录

1.1瓦雷兹芽孢杆菌(B. velezensis)FZB42 1

1.2.1理化性质 1

1.1.2 生物防治的作用机制 2

1.2表面活性素Surfactin 3

1.2.1 脂肽类化合物 3

1.2.2 理化性质 3

1.2.3 抗菌的作用机制 4

1.3 研究目的与意义 4

二.实验材料 5

2.1实验菌株 5

2.2 培养基配方 5

三.实验步骤 8

3.1突变株表面张力测定 8

3.2.突变株对病原菌的拮抗作用 8

3.2.1拮抗巨大芽孢杆菌的活性测定 8

3.2.2 拮抗啤酒酵母的活性测定 9

3.2.3拮抗腐皮镰刀菌的活性测定 9

四.实验结果与分析 10

4.1突变株表面张力的测定 10

4.2 对病原菌的拮抗作用 12

4.2.1拮抗巨大芽孢杆菌的活性 12

4.2.2 拮抗啤酒酵母的活性 15

4.2.3拮抗腐皮镰刀菌的活性 17

五. 讨论与分析 19

六.致谢 20

参考文献 21

一.文献综述

如今使用化学肥料或农药是在养殖和耕作中防治病虫害以及增加产量的主要手段,然而如果长期采用这种手段,农药的残留将改变原有土壤的的成分及环境,施药对象也会产生抗药性,最终不仅容易使病虫害的防治效果差,还容易对原有生态环境产生一定程度的污染破坏,因此,现今各国家更重视生物防治[1, 2]。生物防治中大多用芽孢杆菌[3],研究表明瓦雷兹芽孢杆菌(B. velezensis)FZB42菌株不仅具有可以与多种病原菌产生拮抗作用的能力,还对促进植物生长,提高植物病害抗性有着积极的意义。生防微生物对病原体产生拮抗作用的拮抗物质分为两类,一类是抗生素类,另一类是拮抗蛋白。本文研究内容是脂肽类化合物即表面活性素Surfactin,它被Arima[4]首次发现,具有抗病毒、抗细菌活性的作用。但目前为止,对生物表面活性剂的研究主要集中在糖脂类表面活性剂,而对脂肽类生物表面活性剂研究相对较少,还处在初步阶段[5],生防机理研究的不够深入明确。而且脂肽类生物表面活性剂产量较低,生产成本较高,现如今并不能实现大规模的工业应用。随着生物技术的不断进步和生物工程的发展以及人们对其的需求,对脂肽类生物表面活性剂尤其是对产生菌株的研究不断深入,有利于进一步认识脂肽的生产调控机制,进而通过构建基因工程菌和优化培养条件、改善分离工艺等手段在将来能大规模应用此类物质。ROMERO等研究表明在芽孢杆菌产生的三大家簇脂肽类抗生素中主要由Bacillomycin D和Fengycins起拮抗作用,但Surfactin对病原菌有明显抑菌效果[6, 7]

1.1瓦雷兹芽孢杆菌(B. velezensis)FZB42

1.2.1理化性质

瓦雷兹芽孢杆菌(B. velezensis)FZB42是一株杆状革兰氏阳性细菌,也是一株促生根际细菌(PGPR,plant growth-promoting rhizobacteria),具有运动性,通常生长在土壤中或定殖于植物根部,能产生丰富抑菌活性的次级代谢产物,并促进植物生长。该菌株表面粗糙,液体培养会生成菌膜而在固体培养基上的菌落呈淡黄色[8-10]。瓦雷兹芽孢杆菌(B. velezensis)FZB42 具备合成十几种不同的抗生素的能力,其中包括一些脂肽类化合物、聚酮类化合物、多肽类化合物等,是具有高效生防性能的模式菌株[11]。且作为首个被全基因组测序的菌株,对瓦雷兹芽孢杆菌(B. velezensis)FZB42的基因组序列研究最为深入。瓦雷兹芽孢杆菌(B. velezensis)FZB42具有抗逆性强,杀菌高效,耐高温,耐酸碱,抗紫外线,防治效果好,易于制作且成本低等优点。

1.1.2 生物防治的作用机制

植物微生物学有一种理论:植物体表和体内的微生物学群落在植物健康的时候是一个动态平衡的生物系统,当平衡打破时植物就会发生病害;生物防治则是在被病原菌占据优势的生物系统中加入微生物,形成不利于病原菌生长的环境控制病原菌的生长,形成新的动态平衡体系。

1.1.2.1 竞争作用和拮抗作用

瓦雷兹芽孢杆菌(B. velezensis)FZB42主要有成功定殖在植物根系,与病原菌争夺营养和空间以及分泌拮抗物质例如抗生素、细胞壁降解酶类等以抑制病原菌生长,这两方面来达到生防的目的[12-14]

1.1.2.2溶菌作用

瓦雷兹芽孢杆菌(B. velezensis)FZB42能够吸附在病原真菌的菌丝上,产生溶菌物质消解菌丝体,从病原菌孢子就发生作用,使之失去生物学活性达到生物防治的效果[15],例解淀粉芽孢杆菌YN-1能抑制棉花枯萎病菌[16]。一方面,发生孢子裂解,出现内容物外溢现象;另一方面,使菌丝体出现瘤状畸形,生长受到抑制[17, 18]

1.1.2.3诱导植物系统抗性

瓦雷兹芽孢杆菌(B. velezensis)FZB42能产生诱导植物系统抗性的各种诱导子来激活植物自身的物理或化学防御:当植物检测到诱导子后,茉莉酸(JA)、乙烯(ET)和水杨酸(SA)信号通路被激活,从而提升植物对病原体的抗性 ,间接地减少病害发生,例如,诱导免疫系统中的酶的活性变化等。细菌诱导剂的特性对于理解植物对病原均的防御启动机制,进而指导农业生产具有重要意义。

1.1.2.4促生作用

瓦雷兹芽孢杆菌(B. velezensis)FZB42不仅能抑制病原菌的生长,还能促进植株生长 ,提高植物品质,是作为微生物肥料的主要成分之一。不仅能提高种子发芽率,还能促进种子发芽,幼苗生长迅速,降低作物硝酸盐含量。

1.2表面活性素Surfactin

1.2.1 脂肽类化合物

脂肽主要可分为以下几类:表面活性素类(Surfactin),帕米拉素(Pumilacidin)伊枯草素类(Iturin),芬芥素(Fengicin),大侧柏素(Plipastatin),地衣素(Lichenysin),多粘菌素(Polymixin)等[19]。而本文研究的只是其中一种即表面活性素Surfactin。

其体内毒性低,并不需要再多做去除毒性的这一步骤;其能够作为生物控制剂取代化学杀虫剂 ,使得食品工业的有机废料经细菌转化成具有生物杀虫剂作用的有机废料 ,有效地实现了有机废物循环利用;还能除去受污染土壤中的重金属离子;还能降解有害农药,尤其是化学试剂留在土壤中的有害成分。

1.2.2 理化性质

表面活性素Surfactin由1个手性序列为LL-DLLDL的七肽和1个含13到15个碳原子的β-羟基脂肪酸构成。表面活性素Surfactin具有很强的溶血活性,抗病毒、抗支原体、抗细菌活性。瓦雷兹芽孢杆菌(B. velezensis)FZB42在Landy培养基中培养10小时左右是产量最高的时候,因此一般培养10小时为研究Surfactin的最佳培养时间。LB培养基只能满足菌株基本培养要求,而Landy培养基则在此基础上诱导抗生素形成。

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