摘 要

马尾松在我国的分布范围很广，是重要的材用树种。转录组学是基因组学研究的重要部分，随着第二代测序技术的出现和成熟，特别是是RNA-seq技术，它能对数十万甚至数百万条核酸序列同时测序，转录组学研究飞速发展。本实验是利用转录组测序手段研究马尾松球果发育，通过提取RNA、RNA质量检测、文库构建、高通量测序等步骤，以马尾松7个时期的球果RNA-Seq数据为基础，对其各个时期KEGG富集通路（pathway）、富集GO条目（term）以及差异表达基因（DEGs）内容进行解析，初步得出马尾松球果各发育时期分子层面的变化规律。如进行GO功能分类注释时，发现除了在雌雄配子体融合时期，上调和下调的数量变化趋势是随着球果的发育而逐渐增高，KEGG通路富集分析中差异表达基因数量的变化趋势也与之类似。

关键词：马尾松；RNA-Seq；差异表达基因；球果

Analysis of differentially expressed genes related to cone development in Pinus massoniana at different stages

ABSTRACT

Pinus massoniana is an important timber tree species with wide distribution in China. Transcriptome an important part of genomics. With the emergence and maturity of the next generation sequencing technology, especially RNA-seq technology, it can sequences hundreds of thousands or even millions of nucleic acid sequences simultaneously. Transcriptome has developed rapidly. In this experiment, the cone development of P massoniana was studied by transcriptome sequencing. By extracting RNA, RNA quality detection, library construction, high throughput sequencing and other steps, based on the cone RNA-Seq data of P massoniana in seven periods, the KEGG pathways, GO terms and DEGs in each period were analyzed, and the preliminary results were obtained. Molecular changes of cones at different developmental stages. For example, when annotating GO functional classification, we found that the number of up-regulated and down-regulated genes increased with the development of cones in addition to the gametophyte fusion period, and the number of differentially expressed genes in KEGG pathway enrichment analysis was similar.

Key word:Pinus massoniana; RNA-Seq; EDGs; cone

目 录

1 文献综述

1.1 转录组 1

1.1.1 转录组学概述 1

1.1.2 转录组学的研究方法 1

1.1.3 转录组分析的应用 2

1.2 马尾松的生物学特性 3

1.3 数据库注释 3

1.4 目的和意义 3

2 材料与方法 5

2.1 材料 5

2.2 主要仪器 6

2.3 RNA提取 6

2.4 RNA质量检测、文库构建、高通量测序 6

2.4.1 RNA质量检测 6

2.4.2 文库构建 6

2.4.3 分析流程 7

3 结果与分析 9

3.1 样品RNA质量 9

3.2 测序数据统计及质量评价 10

3.2.1 原始测序数据统计及质量评价 10

3.2.2 Clean read测序数据统计及质量测序 11

3.3 unigene组装 12

3.4 差异表达基因 12

3.5 GO功能分类注释 14

3.6 GO功能富集分析 16

3.7 KEGG通路富集分析 17

讨 论 19

结 论 20

致 谢 21

参考文献 22

1 文献综述

1.1 转录组

1.1.1 转录组学概述

遗传信息从DNA转到RNA的生物进程称为转录^[1][2]。在整体水平上，通过对基因的结构和功能的研究，探究转录调节规律和基因转录的分子机理的学科是转录组学（transcriptomics）^[3]，在基因组学研究中，转录组学有着的不可或缺的地位^[4]。

Velculescu等提出了转录组（transcriptome）的概念^[5]，转录组的概念是指某一物种中的特定部位转录的全部RNA。因此，转录组可以体现该个体在具体时段里具体部位（细胞、组织、器官）的所有基因转录表达水平，借此可揭示基因转录表达的时空动态性，同时，也可比较不同环境下的某一细胞、组织、器官的基因表达差异。

新一测序技术（Next Generation Sequencing,简称NGS）的出现和发展，使测序的费用大幅度降低，并提高了测序速度，弥补了第一代测序技术非自动化、通量低等缺点，新一代测序技术大大推动了转录组学研究的发展。

1.1.2 转录组学的研究方法

当前，转录组学测序技术主要包括了基因芯片（gene chip）、基因表达系列分析技术（serial analysis of gene expressiong,SAGE）、RNA测序技术（RNA sequencing,RNA-Seq）、表达序列标签技术（expressed sequence tags,EST）和大规模平行测序技术（massively parallel signture sequencing,MPSS）^[6]。其中EST技术出现的较早，其他技术的出现则大大推动了转录组学研究的进程。随着NGS的发展与成熟，RNA-Seq测序技术具有测序高通量、成本较低、速率快等优势，因此从众多技术中脱颖而出，成为转录组学研究分析主要手段。

1.1.2.1 表达序列标签技术