摘 要

本研究以南林‘895杨’组培苗成熟叶片和未成熟叶片为材料，利用酶解法对两种发育时期的组培苗叶片进行酶解制备游离叶肉细胞，研究了影响细胞得率及细胞活力的诸多因素，对酶解条件进行系统优化，构建了南林‘895杨’游离叶肉细胞的培养体系。具体研究结果如下：

两种不同发育程度的组培苗叶片，所需要的酶解液浓度、酶解时间不同，最后游离叶肉细胞的细胞得率、细胞活力等方面也有差异。成熟叶肉细胞的最佳酶解液为0.15%果胶酶Y-23 0.05%纤维素酶RS，最佳酶解时间6 h，细胞得率高达10.039×10⁷个/g•FW，细胞活力达到63.757%；未成熟叶肉细胞的最佳酶解液为0.15%果胶酶Y-23 0.08%维素酶RS，最佳酶解时间8 h，细胞得率为9.441×10⁶个/g•FW，细胞活力为56.626%。所得游离叶肉细胞形态良好，颜色鲜绿，叶绿体在细胞内均匀分布，既没有出现质壁分离，也没有出现细胞膨胀。成熟叶片酶解后所得离体叶肉细胞数量更大、活力更高，更适宜于分离叶肉细胞的原材料；未成熟叶片酶解后尽管细胞数量和活力稍有不足，但是未成熟叶片的叶肉细胞更适合的细胞转分化试验研究。

关键词：南林‘895杨’；叶肉细胞；酶解

Construction of the in vitro system of isolated mesophyll cells of Populus×euramericana Nanlin ‘895’

Abstract

Using Populus×euramericana Nanlin ‘895’ tissue culture seedlings＇mature leaves and immature leaves as experimental materials, we separated the mesophyll cells by enzymatic hydrolysis methods. Many factors that affectted the free mesophyll cells rate and cell viability in different developmental leaves were investigated, and also the optimizable, enzymatic hydrolysis conditions were selected systematically. Finally, the mesophyll cell in vitro cultural system was built. The specific research results were shown as follows:

The enzymolysis of different development degree leaves required different enzyme concentration and time, and also the isolated mesophyll cell yield and viability were different. The best enzymatic hydrolysis conditions of mature mesophyll cells was 0.15% pectolase Y-23 0.05% and cellulase RS, 6 h enzyme dissolved, the isolated mesophyll cell yield and viability was 10.039×10⁷/(g•FW) and 63.757% respectively. Equally, the best enzymatic hydrolysis conditions of immature mesophyll cells was 0.15% pectolase Y-23 0.08% and cellulase RS, 8 h enzyme dissolved, the isolated mesophyll cell yield and viability was 9.441×10⁶/(g•FW) and 56.626% respectively.The isolated mesophyll cells shape were nomal with green color. Chloroplasts were uniform distribution in cells.There was neither a qualitative wall separation nor a cell expansion. The obtained isolated mesophyll cells of mature leaves had more amount and higher cell viability which are more suitable for isolating mesophyll cells. The isolated mesophyll cells of immature leaves were more suitable for later studies though having shortages in amount and cell viability.

Keywords: Populus×euramericana Nanlin ‘895’; mesophyll cells; enzymolysis

目 录

1 文献综述 1

1.1 单细胞分离研究概况 1

1.2 单细胞分离获取途径和方法 1

1.2.1 从外植体中直接分离单细胞 1

1.2.2 从愈伤组织中分离单细胞 2

1.2.3 通过原生质体再生法获得单细胞 3

1.3 单细胞分离方法存在的问题 3

1.4 本项研究的目的与意义 3

2 南林‘895杨’叶肉细胞的分离 5

2.1 材料与方法 5

2.1.1 实验材料 5

2.1.2 实验方法 5

2.1.2.1 叶肉细胞的分离 5

2.1.2.2 叶肉细胞的培养及观察 8

2.1.2.3 数据统计与处理 10

2.2 实验结果与分析 10

2.2.1 南林‘895杨’组培苗成熟叶片叶肉细胞的分离 10

2.2.1.1 酶解液配比的优化 10

2.2.1.2 渗透压的优化 12

2.2.1.3 酶解时间的优化 13

2.2.2 南林‘895杨’组培苗未成熟叶片叶肉细胞的分离 14

2.2.2.1 酶解液配比的优化 14

2.2.2.2 渗透压的优化 16

2.2.2.3 酶解时间的优化 17

2.2.3 成熟叶片与未成熟叶片酶解效果的比较 18

2.3 结论与讨论 19

2.3.1 完整叶肉细胞的分离条件解析 19

2.3.2 不同发育期叶肉细胞的分离 19

致谢 25

参考文献 26

1 文献综述--植物单细胞分离研究进展

1.1 单细胞分离研究概况

进行细胞分离时，直接对器官、组织等用酶解法或非酶解方法处理，会得到细胞及残渣等混合物。为了从细胞水平研究生物体的结构、组分、代谢等生物学问题，我们必须获得数量可观、单一种类的游离单细胞，同时必须保证所得细胞具有较高的纯度和细胞活力。更为特别的是，如果要进一步研究细胞的功能及分子生物学特性，必须在试验之前将所需的特定细胞从其自然环境中分离纯化出来，相应要求会更高。所以，单细胞游离体系的构建是植物发育生物学研究经常涉及的问题。通常获得植物游离单细胞的方法主要有外植体分离法、愈伤组织诱导法和原生质体再生法。

1.2 单细胞分离获取途径和方法

1.2.1 从外植体中直接分离单细胞

1.2.1.1 机械法

Ball和Joshi （1965）于1965年最初利用刀片刮叶片法以花生（Arachis Linn.）成熟叶片作为研究材料，分离获得叶肉单细胞，即将叶片上表皮或下表皮撕掉，部分叶肉细胞暴露出来，借助解剖刀慢慢将细胞刮离开来。在此后，人们用这种方法相继从稗草（Digitaria sanguinalis）（Edwards .et al，1971）、紫八宝（Sedum telephium）（Rouhania .et al，1973）和芦笋（Asparagus cladophylls）（Colman .et al，1979）等多种植物中分离得到叶肉细胞，并能够分裂和形成愈伤组织。通常我们认为机械法只适用于薄壁组织排列松散、细胞间接触点较少的植物组织，即对该种类的植物组织而言，用机械法分离叶肉细胞才可能取得成功。