摘 要

柽柳（Tamarix chinensis Lour.）是原产自我国的柽柳属植物，作为耐盐性最高的木本植物之一，其耐盐性研究对于植物耐盐机理的阐明具有重要价值。在盐碱、干旱等胁迫下，植物胚胎发育晚期丰富表达基因即Lea(Late embryogenesis abundant proteins，LEAP)基因大量表达，可以显著加强植株在逆境下的存活能力，是植物耐盐基因研究的重要对象。本研究以柽柳叶为实验材料，利用Illumina高通量测序得到的转录组数据筛选序列，克隆柽柳Lea基因并对其进行序列分析。结果表明该基因cDNA序列与白花柽柳的相似性均达97%，编码102个氨基酸，编码的LEA蛋白为高度亲水的碱性球形蛋白，和LEA_3蛋白较为匹配，推测为LEA_3蛋白。通过氨基酸序列分子系统进化分析，柽柳与同科植物白花柽柳在进化上最近。

关键词：柽柳，LEA蛋白，基因克隆，生物信息学分析

Cloning and sequence analysis of Tamarix chinensis salt-tolerant genes (Lea gene)

ABSTRACT

Tamarisk (Tamarix chinensis Lour.) takes origin from China，it belongs to Tamarisk genus. Tamarisk is a kind of the highest-salt-tolerance woody plants.The research of its salt tolerance ability has great value on the plant’s salt tolerance mechanism. The Lea（Late embryogenesis abundant proteins，LEAP) gene expresses abundantly when plants respond to salt and drought stress. It can significantly strengthen the survival ability of plants under stress. The Lea gene is important to plant salt-tolerance gene research.Using the material of Tamarix chinensis leaves, research cloned the Lea gene and analyzed it according to the sequences screening in Illumina transcriptome sequencing data.The result shows that the Lea gene cDNA of Tamarix chinensis and Tamarix albiflonum has great similarity (97%),and this gene encodes 102 amino acids. The protein encoded by the Lea gene is highly hydrophilic alkaline globular protein. It matches very well with the LEA_3 protein family, indicating that this protein is a LEA_3 protein. According to phylogenetic analysis of amino acid sequences, Tamarix chinensis is most similar to Tamarix albiflonum in evolution which belongs to the same genu.

Key words：Tamarix chinensis Lour.；LEA protein；Gene cloning；Bioinformation analysis

目 录

1 文献综述 - 1 -

1.1 柽柳生物学特性与资源利用 - 1 -

1.2 柽柳的耐盐机理 - 1 -

1.21 盐胁迫对植物的影响 - 2 -

1.2.2 植物常见耐盐机制 - 2 -

1.2.3 柽柳耐盐机制 - 2 -

1.3 LEA蛋白 - 3 -

1.3.1 LEA蛋白的结构、性质、分布 - 3 -

1.3.2 LEA蛋白分类 - 4 -

1.3.3 LEA蛋白的功能和调控 - 5 -

1.4 本研究的目的与意义 - 6 -

2 柽柳Lea基因全长cDNA克隆 - 6 -

2.1 实验材料 - 6 -

2.2 实验仪器 - 6 -

2.3 实验准备 - 6 -

2.3.1 器材的预处理 - 6 -

2.3.2 连接载体与转化用感受态 - 6 -

2.3.3 LB和SOC培养基的制备 - 7 -

2.4 实验方法 - 7 -

2.4.1 柽柳Lea基因序列的获取 - 7 -

2.4.2 柽柳叶片总RNA的提取与纯化 - 7 -

2.4.3 RNA质量检测 - 9 -

2.4.4 mRNA反转录获得3’cDNA - 9 -

2.4.5 3’RACE引物设计 - 10 -

2.4.6 3’RACE巢式PCR扩增 - 10 -

2.4.7 目的片段回收 - 11 -

2.4.8 3’目的片段与T载体的连接 - 12 -

2.4.9 T载体重组子的制备 - 12 -

2.4.10 重组子的鉴定 - 13 -

2.4.11 5’RACE引物设计 - 13 -

2.4.12 mRNA反转录获得5’cDNA - 13 -

2.4.12 5’片段克隆 - 16 -

2.4.13 生物信息学分析 - 16 -

2.5 实验结果与分析 - 17 -

2.5.1 柽柳Lea基因CDS的获得 - 17 -

2.5.2 柽柳Lea基因的同源序列查询 - 19 -

2.5.3 柽柳LEA蛋白一级结构及理化特征分析 - 20 -

2.5.4 柽柳Lea二、三级结构预测和功能分析 - 22 -

2.5.5 LEA蛋白氨基酸序列构建系统发育树 - 23 -

3 结论与讨论 - 25 -

3.1 结论 - 25 -

3.2 柽柳LEA蛋白分类探讨 - 25 -

3.3 RACE引物设计小结 - 25 -

3.4 研究展望 - 26 -

致 谢 - 27 -

参考文献 - 28 -

1 文献综述

1.1 柽柳生物学特性与资源利用

柽柳属（Tamarix）植物全世界范围内约90种，主要分布于亚洲大陆和北非，部分分布于欧洲、南非西海岸（张鹏云，1990）。柽柳属植物起源于第三纪“古地中海”沿岸地区（庞新安等，2008），抗旱耐盐、喜砂喜水，生长迅速、抗逆性很强。我国产18个种和1变种，大多种主要分布于西北及华北地区，无叶柽柳（T.aphylla）仅在台湾地区有引种栽培（韩琳娜，2010），多以灌木丛形式生于干旱荒漠、半干旱或海滨盐碱地，具有很强干旱、盐碱、瘠薄适应性。本研究所用物种为柽柳（Tamarix chinensis Lour.），属于柽柳科（Tamaricaceae），柽柳属（Tamarix），俗称三春柳、红荆条，乔木或灌木，高3-6米；枝条常见两类，木质化的生长枝经冬不落，绿色营养小枝冬天脱落；鳞片状小叶，无柄互生，具泌盐腺体；春夏秋季开花，每年开花三次，花期4-9月。就分布区而言是我国柽柳属中分布最广的一个种，野生于辽宁、河北、河南、山东、江苏（北部）、安徽（北部）等省；喜生于河流冲积平原，海滨、滩头、潮湿盐碱地和沙荒地，日本、美国也有栽培（张鹏云，1990）。

柽柳属物种具有生态、园艺、药用、经济多方面的价值。柽柳属植物是优良的盐碱地造林树种，也是荒漠河岸植被中的重要建群植物，生态价值显著，柽柳的根系发达可以防风固沙保持水土，作为泌盐植物可以稀释土壤盐分、改良土壤性质；一些种枝形优美、花枝浓密且花期较长，有一定的美化、观赏价值，多年生柽柳根部可以作为根雕、盆景材料，是优良的风景园林植物；目前已发现的柽柳属植物化学成分中黄酮类成包括柽柳素、柽柳苷等，萜类化合物有柽柳酮、柽柳醇等，其他还包括一些酚类、苯丙酸类成分（韩琳娜，2010；廖菁等，2012）。柽柳属植物的生长迅速，可以快速积累干物质，新枝生长迅速，幼叶适口，是可快速再生的能源树种与农牧饲料植物；幼叶可作为中草药，枝条可作为栲胶等化工产品的提取原料（刘春杰，2006）。外，在中药与化工方面，除了柽柳本生的药用价值外，柽柳的寄生植物肉苁蓉属植物作为名贵中药材药用价值巨大，随着肉苁蓉产业兴起对寄主的研究利用迅速升温。