摘 要

反向促旋酶是一种从超嗜热菌中分离得到的拓扑异构酶，它可以将正超螺旋引入到底物DNA之中。在我们的研究中发现，DNA正超螺旋可以通过反向促旋酶引入到pBR322质粒之中，得到的正超螺旋分子通过原子力显微镜扫描鉴定其构型，通过与右手螺旋的负超螺旋分子比较，我们确认了正超螺旋分子以左手螺旋方式缠绕。此外，进一步的结构比较表明，相比于负超螺旋分子，正超螺旋DNA分子的AFM图像显示出轮廓长度有所增加。此外，我们用酶促法分析表明，正超螺旋DNA不能被T7核酸内切酶切割。以上所有证据均表明，正超螺旋的这种过旋结构可以防止基因组双链DNA随机形成一些单链DNA区和链内二级结构。

关键词：反向促旋酶；pBR322质粒；正超螺旋；T7核酸内切酶；原子力显微镜检测

Direct observation of positive supercoils introduced by reverse gyrase through atomic force microscopy

ABSTRACT

Reverse gyrase is a hyperthermophilic enzyme which can introduce positive supercoiling to its substrate DNA. It is demonstrated in our studies that positive DNA supercoils could be induced into pBR322 vector by reverse gyrase and the left-handed structures adopted by positively supercoiled DNA molecules could be identified from their right-handed topoisomers through atomic force microscopic examination. In addition, further structural comparison revealed that the AFM images of positively supercoiled DNA molecules exhibited the increased contour lengths. Moreover, our enzymatic assays showed that the positively supercoiled DNA cannot be cleaved by T7 endonuclease. All evidence suggested that the overwinding structure of positive supercoil could prevent the genomic duplex DNA from randomly forming some single-stranded DNA regions and intra-stranded secondary structures.

Key words：reverse gyrases； pBR322 vector；positive supercoil； T7 endonuclease, AFM examination

目 录

1文献综述…………………………….........................................…………………………………1

1.1 DNA结构……………………...……………………………..………………………………1

1.2拓扑异构酶的分类……………………………………………………....……………..……3

1.3 non-B结构与DNA超螺旋……………………………………….……………….…………4

1.4原子力显微镜…………………………………………………….…………….……………6

1.4.1原子力显微镜的工作原理………………………………..…………….………………6

1.4.2原子力显微镜的应用…………………………………..…………….…………………7

2实验材料与方法…………………………………………….... ....................................…………9

2.1试剂材料………………………………………........................……..............………………9

2.2实验仪器……………………………………………..........................................……………9

2.3 反促旋酶与质粒DNA的反应…………………….......................................………………9

2.4 EcTopo I与超螺旋质粒的反应……………………......................................………………9

2.5 T7核酸内切酶I与超螺旋质粒的反应………………………...........................….………10

2.6 DNA样品制备和AFM检查的实验流程………………...............................……….……10

3 实验结果与讨论…………………………………………………………………..……………11

3.1 反向促旋酶将左手螺旋引入pBR322质粒中的鉴定……....................... .........…………11

3.2正超和负超螺旋的DNA之间的结构参数比较........…………......................................…12

3.3在超螺旋DNA中的过旋和解旋结构的酶学测定........…………...................................…13

结论........……………………………………...........................………………………. .…………14

致谢……………………………….....................................................................………….………15

参考文献 ……………………………...................................................................….……………16

1文献综述

1.1 DNA结构

DNA是细胞内主要的遗传物质。DNA的基本单位是核苷酸，核苷酸是由戊糖、碱基和磷酸构成。DNA在空间结构上又可分为一级、二级和三级结构。所谓的一级结构指的是四种不同核苷酸残基的组成、排列顺序，通常所说的核酸一级结构是用碱基的排列顺序来表示，碱基是遗传信息的携带形式；所谓的二级结构是由氢键联系起来的结构，通常来讲是指DNA的双螺旋结构；而三级结构也就是DNA的三位结构，它指的是DNA双链在空间上的缠绕折叠，它属于拓扑学研究的范畴，从而也被称之为DNA的拓扑结构^[1,2]。