摘 要

柳杉（Cryptomeria fortunei）是我国南方重要的针叶用材树种之一，具有较高的木材利用价值以及良好的栽培经济效益。能适应寒冷、瘠薄等不良环境，抗风抗雪压能力及抗逆性也很强。另柳杉树形高大，树姿雄伟优美，也是很好的园林风景树种。本研究以柳杉为实验材料，通过分子克隆等技术成功地获得了与柳杉抗寒性相关的ICE基因全长序列，并通过构建超表达载体将ICE基因转入拟南芥植株中进行功能验证，为将来对柳杉抗寒性进行更深入研究提供了一定的理论依据。主要研究成果如下：

1. 利用RT-PCR结合RACE的方法，扩增出ICE基因全长2534bp，其中包含一个1728bp的开放阅读框，编码着575个氨基酸，并确定其为柳杉ICE1基因。
2. 利用双酶切手段，构建了柳杉ICE基因的过量表达载体，成功地将ICE基因连接到载体上并转入拟南芥中，经筛选鉴定获得拟南芥转基因植株。通过低温胁迫及恢复实验，确定了ICE基因均具有提高植株抗寒性的功能。

3、根据基因表达量分析得出，转基因植株中ICE基因表达量随着低温胁迫时间增加而上调，表明其与抗寒性相关。

关键词：柳杉；抗寒性；基因克隆；功能验证

Cloning and Functional Verification of ICE Gene in Cold resistant Cryptomeria fortunei

ABSTRACT

Cryptomeria fortunei is one of the important Coniferous timber tree species in south China, which has a high value of wood utilization and good economic benefit of the cultivation. It can adapt to the bad environment, such as coldness, drought and so on. It has very strong wind resistance and snow pressure ability, as well as stress resistance. Besides, the tree is tall, majestic and beautiful. It is also one kind of the very good landscape tree species. In this study, the full-length sequences of cold-resistant genes related to ICE was successfully obtained by molecular cloning technology, and transferred ICE gene into Arabidopsis thaliana through the expression vector for functional verification. The research on the cold resistance of Cryptomeria will offer theoretical basis for the further study in the future. The main findings are as follows:

1. Using RT-PCR to combine the method of RACE, the ICE gene that has been amplified has a total length of 2534bp, which contains an open reading frame of 1728bp, encoding 575 amino acids. It is identified as C. Fortunei ICE1 gene.

2、Using the technology of double digestion, the over-expression vector of ICE gene was constructed, and the gene was successfully transgened into A. thaliana. After the selection and identification, the transgenic plants of A. thaliana were obtained. We identified the function of improving cold resistance of ICE gene by cold stress and recovery experiments.

1. According to the expression analysis, we found the expression of gene up-regulated with the time of cold stress in the transgenic plants. Indicating that the genes are related to cold resistance.

Key words: Cryptomeria fortunei; Cold resistance; Gene clone; Functional verification

目 录

1 文献综述 1

1.1 柳杉基本状况 1

1.1.1 柳杉的起源及天然分布 1

1.1.2 柳杉的生物学特性 1

1.2 低温对植物的影响 1

1.2.1 低温对植物膜系统的影响 1

1.2.2 低温对抗氧化酶的影响 2

1.2.3 低温对渗透调节物质的影响 3

1.3 有关植物抗寒基因的结构和功能研究 3

1.3.1 COR 基因 3

1.3.2 CBF转录因子 4

1.3.3 ICE基因 4

1.4 研究目的、意义 5

2 实验材料与方法 6

2.1 实验材料与试剂 6

2.1.1 实验材料 6

2.1.2 载体与菌株 6

2.1.3 主要实验试剂 6

2.1.4 主要仪器设备 6

2.1.5 引物合成及测序 6

2.2 实验方法 7

2.2.1 总RNA的提取 7

2.2.2 RNA检测 8

2.2.3 RNA反转录 8

2.2.4 柳杉ICE基因同源片段的分离 9

2.2.5 柳杉ICE基因全长克隆 12

2.2.6 真核表达载体构建 15

2.2.7 拟南芥的种植 15

2.2.8 农杆菌花序浸染 16

2.2.9 转基因拟南芥的筛选 16

2.2.10 转基因植株的PCR检测 16

2.2.11 转基因拟南芥功能验证 17

3 结果与分析 18

3.1 总RNA提取 18

3.2 ICE基因同源片段克隆 18

3.3 ICE基因全长拼接 18

3.4 真核表达载体构建 19

3.5 农杆菌菌液检测 20

3.6 转基因拟南芥的筛选 20

3.7 转基因植株的PCR检测 22

3.8 转基因拟南芥功能验证 22

3.8.1 表型观察 22

3.8.2 实时定量分析 23

4 讨 论 24

4.1 ICE基因全长的获得 24

4.2 低温胁迫下抗寒表型的差异 24

4.3 基因表达量分析 25

结 论 26

致 谢 27

参考文献 28

1 文献综述

1.1 柳杉基本状况

1.1.1 柳杉的起源及天然分布

柳杉起源于中生代白垩纪后期，到第三纪主要分布于北半球一带，现如今，柳杉不连续地分布在我国南方亚热带的高海拔地区^[1]。我国中南亚热带常绿阔叶林、北亚热带的常绿阔叶林及落叶阔叶林均是柳杉分布的地带^[2]。柳杉天然林分布在中亚热带常绿阔叶林带的北缘，即在浙、闽山丘陵地。

1.1.2 柳杉的生物学特性

柳杉，又称孔雀杉，木沙椤或宝树等，是我国的原产树种，多分布在海拔1000-1500m的山地，在我国西部地区可生长在海拔高达2000-2500m的山地。柳杉适宜生长在温暖湿润气候条下，另外，也要求年降水量在1m以上、年平均气温在14-19℃范围内，并且，1月平均气温要在0℃以上。柳杉较为喜光，是主要生长在暖温带的树种，尤其是，在空气温度大、云雾多、夏季较凉爽的海洋性或山区气候条件下分布较多且长势较好。柳杉主要分布于长江以南的各省区，另外，西南地区也存在一些柳杉分布地带。

1.2 低温对植物的影响

在自然界中，植物不可避免会地遭受各种外界环境因子的刺激，如高盐、干旱和低温等，这些环境因子都极易通过影响细胞膜成分或气孔开度等生理和生化过程，继而对植物造成伤害，严重影响了作物的产量和种质区域^[3]。由此可见，低温是影响植物的生长、生存及分布的重要环境因子。对于植物细胞来说，低温冷害会直接致使细胞代谢缓慢，除此之外，低温冷害也会间接地引起渗透胁迫和氧化胁迫等^[4]。而柳杉是一个喜好温暖湿润条件的树种，较为不耐寒，因此研究柳杉抗寒机理对提高柳杉抗寒性，以及选育抗寒性新品种具有重要的理论意义和现实意义。

1.2.1 低温对植物膜系统的影响

生物膜是植物细胞、细胞器和其周围环境接界的脂双层膜结构，它具有信号转导作用，能够接受和传递周围的环境信息，并会对环境胁迫做出相应的反应。生物膜具有流动性和稳定性，这是细胞甚至是整个植物体都赖以生存的基础。在20世纪70年代，Lyons根据细胞膜的结构及功能与抗寒性之间的关系，提出著名的“膜相变的冷害”假说。假说认为，植物在正常的生理活动中，膜需要呈现液晶相的状态，当植物遭受低温冷害时，首先，生物膜会发生膜脂的物相改变，即膜脂有液晶相状态变成了凝胶相的膜状态，膜脂上的脂肪酸链也从无序排列方式变成了有序排列方式，膜结合酶的活力有所降低，另外，膜的外形和厚度也会发生一些改变，可能会导致膜发生收缩，膜上将出现孔道或龟裂，进而致使膜的通透性增大，膜内电解质、可溶性物质等大量地向膜外进行渗透，最终会破坏细胞内外的离子平衡；与此同时，膜上结合酶的结构改变后，活力会下降，酶促反应失去平衡，进而导致植物细胞生理代谢发生变化，功能紊乱，主要表现为呼吸作用有所下降、供应的能量减少、植物体内迅速积累大量的有毒物质，从而使植物细胞受到一定程度的伤害^[5]。Lyons认为，植物在遭受冷害后，出现的所有代谢变化都是次生或伴生的，而冷害的原初反应却是生物膜上的类脂分子所发生的反应^[6]。膜脂中，膜脂的相变温度受类脂和脂肪酸成分的不饱和度的影响较为明显。一般来说，膜脂中不饱和脂肪酸的含量相对增高的话，膜脂相变温度就会有所降低，从而增加了膜的流动性，使植物的抗寒性得以相应加强；与之相反的话，冷敏感性植株的膜脂相变，很有可能是由于膜脂中脂肪酸的不饱和程度较低而引起的，而后低温下的膜脂由液晶相的膜状态向凝胶相的膜状态转变，从而造成细胞膜的膜相发生分离，最终导致细胞代谢紊乱^[7]。

1.2.2 低温对抗氧化酶的影响

植物在适宜的温度、光照、水分等环境条件下，进行呼吸作用和光合电子传递，此时，植物体内会产生活性氧（ROS），包括羟基自由基、单线态氧、超氧阴离子自由基以及过氧化氢。对于植物正常生理过程来说，含有一定浓度的ROS是生长所必需的，并不会对植物产生伤害^[8]。

在低温胁迫条件下，植物细胞会产生大量的活性氧，极易破坏细胞结构。而植物本身也会形成精细而复杂的防御体系来应对潜在的活性氧伤害，从而确保细胞能够正常生长。在胁迫条件下，植物体内用来抗氧化的防御系统是由一些能够消化活性氧的酶以及抗氧化物质所构成。消化活性氧的酶包括超氧化物歧化酶SOD，谷胱甘肽还原酶GSH-R，过氧化物酶POD，过氧化氢CAT等。抗氧化剂包括胡萝卜素CAR，维生素E，抗坏血酸AsA，谷胱甘肽GSH等。植物体内的防御系统就是通过这些各种保护物质协同作用从而共同抵抗胁迫诱导产生的氧化伤害^[9]。

1.2.3 低温对渗透调节物质的影响

在渗透胁迫过程中，植物为降低体内的水势，会产生一些渗透调节物质，从而维持植物体内的水分平衡。这些渗透调节物质包括甜菜碱、脯氨酸、醇类物质和可溶性糖等。在低温胁迫条件下，植物通过诱导表达产生大量的渗透调节物质，来维持体内渗透压的平衡，从而避免自身受到低温伤害^[7]。渗透调节作用最初是通过降低细胞内束缚水的自由能（即降低细胞内的水势），来维持了细胞内外的水分平衡。在冷害胁迫条件下，细胞膜的通透性增大，使得细胞内有大量物质地渗出，与此同时，植物体内的代谢加强，合成大量的渗透调节物质从而减轻细胞因冷害而受到伤害。

1.3 有关植物抗寒基因的结构和功能研究

植物抗寒分子机制的相关研究表明，在低温条件下，植物体内大量的转录因子会随之激活一系列基因的表达，进而产生一定的抗寒能力。根据DNA结构域的不同，植物体内的转录因子可分为AP2/EREBP类转录因子、bZip类转录因子、zinc-finger类转录因子、MYB/MYC类转录因子及bHLH（basic helix-loop-helix）类转录因子等种类^[10]。ICE[Inducer of CBF（c-repeat-binding-factor）expression]基因属于MYB/MYC类转录因子，含有bHLH结构域，与CBF基因上的MYBR/MYCR元件相结合，从而诱导CBF基因的表达^[11]。

1.3.1 COR 基因

植物COR（cold-regulated）基因为冷诱导基因，在COR基因的启动子区域含有脱水反应元件DRE（dehydration-responsive element），具有5bp核心序列CCGAC即为CRT（C-repeat）。DRE做为顺式作用启动子元件，能够在低温胁迫条件下激活COR基因的表达^[12]。在许多低温反应基因的启动子中都会存在CRT/DRE元件，这对于于受低温诱导的COR基因及其他基因具有重要性的意义^[13]。