摘 要

百合(Lilium spp.)是单子叶植物亚纲百合科(Liliaceae)百合属(Lilium)植物的所有种类的总称。百合也是世界重要的鲜切花之一，因此高效的遗传转化体系的建立在种质资源的保存和辅助育种以及通过基因工程对品种品质进行改良等方面起着重要的作用。

本试验以麝香百合两个品种“雷山”和“白狐狸”鳞片的薄切片为外植体，利用根癌农杆菌介导法，研究了影响其转化的因素，建立了稳定而高效的麝香百合遗传转化体系。农杆菌菌株采用EHA105，含GFP报告基因与卡那霉素（Kan）抗性标记基因。

结果表明，以“雷山”鳞片的薄切片为受体材料，外植体预培养4d有利于农杆菌的侵染，培养基为MS₀ 4.0mg/L Picloram ，pH为5.8；共培养8d，共培养基去除硝酸铵并添加100umol·L^-1 乙酰丁香酮（AS），pH 值5.8，根癌农杆菌OD₆₀₀值为0.4、侵染10 min，能获得较高的转化率；确定‘雷山’鳞片薄切片的抗生素筛选浓度为50mg/L，筛选培养基为MS₀ 4.0mg/L Picloram Kan 50mg/L Cef 100mg/L，在此培养基上筛选抗性愈伤组织。外植体每21d继代一次。将诱导出的抗性愈伤换至植株再生培养基上，将会逐渐再生出抗性植株。

关键词：麝香百合；鳞片薄切片；根癌农杆菌；遗传转化

Abstract

Lilies (Lilium spp.) are monocotyledonous plants belonging to the family Liliaceae and ranked as one of the important cut flowers. The establishment of an efficient transformation system of lilies plays great importance role in preservation of germplasm resources ,assistment of breeding and genetic improvement with respect to ornamental and marketable qualities.

Thin slice of bulbs of Lilium longiflorum “leishan”and“white fox”were used as explants to study the factors affected transformation rate through Agrobacterium-mediated method.A stable and efficient genetic transformation system was established. The A. tumefaciens strain EHA105 harbored the binary vector carrying the neomycin phosphotransferase II and GFP genes in the T-DNA region.

The results suggested that efficient transformation could be gotten with thin slice of bulbs as acceptor. After proper pre-culture on the medium MS₀ 4.0mg/L Picloram, pH=5.8, explants were co-cultivated with A. tumefaciens strain EHA105 which density were OD₆₀₀=0.4 for 10 mins.In the present study ,the best result was obtained when explants were pre-cultured for four days and co-cultured for eight days. High transformation rate was gained when thin slice of bulbs were cocultivated on the medium with the addition of 100 umol·L^-1acetosyringone( AS), and removment of NH₄NO₃.Then explants were transferred on the MS₀ medium containing 30 g/l sucrose, 4 mg/l picloram ,100 mg/l Cef and 50 mg/l Kanamycin to eliminate Agrobacterium and select putative transgenic calli. The explants were subcultures at every 3 weeks. The Kanamycin-resistant calli were successfully regenerated into plantlets after transferring onto picloram-free medium.

Key words：Lilium longiflorum ；Thin slice of bulbs ；Agrobacterium tumefaciens；Genetic transformation

目 录

前 言 1

正 文 2

1 文献综述 2

1.1百合研究概况 2

1.2 百合遗传转化的目的基因 2

1.2.1 报告基因 2

1.2.2抗病基因 2

1.2.3 抗虫基因 2

1.2.4抗病毒基因 3

1.3 百合遗传转化技术 3

1.3.1农杆菌介导法 3

1.3.2电激法 3

1.3.3基因枪法 3

1.3.4花粉管通道法 4

1.4 转化原理 4

1.5百合再生系统 4

1.5.1不定芽再生系统 4

1.5.2愈伤组织再生系统 5

1.5.3体细胞胚再生系统 6

1.5.4原生质体再生系统 6

1.6百合转基因体系的建立 6

1.6.1抗生素的选用 7

1.6.2转化再生植株的筛选 7

1.6.3外植体侵染农杆菌菌液后共培养的时间 7

1.6.4农杆菌菌株的选择 8

1.7遗传转化的检测 8

1.7.1 PCR(polymerase chain reaction)法 8

1.7.2 Southern blot杂交检测 8

1.8 近年百合转化研究进展 9

1.9 实验流程 9

2麝香百合遗传转化体系建立 11

2.1材料与方法 11

2.1.1植物材料 11

2.1.2 菌株与根癌农杆菌的活化 11

2.1.3 根癌农杆菌介导麝香百合的转化步骤 11

2.2农杆菌介导的遗传转化体系的建立 12

2.2.1 pH和硝酸铵对转化的影响 12

2.2.2百合鳞片抗生素敏感性的确定 12

2.2.3 预培养时间对转化的影响 12

2.2.4共培养时间对转化的影响 12

2.2.5乙酰丁香酮（acetosyringone，AS）浓度对转化的影响 13

2.3 结果与分析 13

2.3.1 pH和硝酸铵对转化的影响 13

2.3.2 百合鳞片抗生素敏感性确定 13

2.3.3预培养时间对转化的影响 15

2.3.4 共培养时间对转化的影响 15

2.3.5 AS浓度对转化的影响 16

结 论 17

讨 论 18

1 遗传转化受体的选择 18

2 农杆菌介导法 18

3 抗生素敏感性 18

4 预培养的影响 19

5 共培养的影响 19

6 AS的影响 19

7 推广应用 20

致 谢 21

参考文献 22

前 言

百合属于百合科单子叶植物，是重要的球根花卉。切花百合因其花朵硕大，色彩丰富，花姿优美成为世界上著名的观赏植物，在在国内外得到广泛应用；而药用百合因其具养咽清肺，清心安神等药用功能，也广泛应用于食品和医药工业^[[1]]。百合作为著名的切花花卉，其观赏价值带来巨大消费市场。加强百合育种具有很高的经济效益和社会效益。长期以来其品质的改良都是依赖于传统的遗传育种方法。植物分子生物学的迅速发展, 为改良植物品质和性状提供了全新的途径, 利用转基因的手段改良百合性状和品质变得切实可行。良好的受体系统是百合基因转化的一个关键技术环节, 高效、稳定且再生能力强的植物受体系统的建立是实现基因转化的先决条件。而培育出具有抗逆性、抗病性、抗衰老等目标性状的百合新品种，对于百合育种无疑具有重要意义。因此开展百合的基因工程看来势在必行。

百合是单子叶植物，一般认为其不是农杆菌的有效寄主，以往在百合转化上主要采用外源基因直接导入法。近年来，才开展了些农杆菌介导法的实验研究并取得了转化成功，但整个百合遗传转化体系的建立还不完善，影响转化的诸因素有待进一步研究。