摘 要

柳杉既是高山速生用材树种，又是优良的庭园观赏树种，为中国珍贵用材树种之一，有着很高的经济价值。

本实验以福建省霞浦杨梅岭国有林场中随机选取的8株来自不同种源的柳杉无性系为原材料，参考日本柳杉研究相关文献中选择的106对引物并从中筛选出26对多态性引物进行SSR-PCR试验。得出柳杉的SSR-PCR最优反应体系为Mg² ：2.0mM，dNTP：0.15mM，Taq聚合酶：0.5U，引物：0.3μM，DNA模版：20ng；扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环，72℃延伸8min，4℃保存。

本试验优化体系能用于柳杉大量SSR引物的筛选，并得到理想的结果。这为柳杉SSR分子标记分析其种质资源遗传多样性、指纹图谱的构建、分子辅助选择育种等提供了可靠的实验手段。

关键词： 柳杉； SSR-PCR； 引物； 优化

Abstract

Cryptomeria fortunei is a fast-growing timber species in mountains and excellent ornamental tree in gardens， one of the valuable trees for timber species in China， and has a very high economic value.

We randomly selected 8 C. fortunei clone as material which from Yang Meiling the State-owned forest farm in Xiapu Fujian province. And the SSR-PCR test used 26 of 106 pairs of primers which referred to in the documents related to the study of C.japonica in Japan. Finally we came out the system that the C. fortunei SSR-PCR optimal reaction is: Mg² 2.0mM, dNTP 0.15mM, Taq polymerase 0.5U,primer 0.3μM, DNA template 20ng,and the amplification procedure is: pre-degenerate at 94℃ for 5min,degenerate at 94℃ for 30s,annealing at 60℃ for 30s,elongate at 72℃ for 45s,30 cycles,elongate at 72℃ for 8min, store at 4℃.

The optimization system in this test can be used for the the C. fortunei SSR primer sreening and get the desired results. It can provide methods for SSR analysis of C. fortunei genetic diversity of species resources, construction of fingerprinting, molecular assisted selection breeding and so on.

Key words: Cryptomeria fortunei; SSR-PCR; primer; optimization

目 录

1 文献综述 1

1.1柳杉的概况 1

1.1.1生物学特征 1

1.1.2分布 1

1.1.3经济价值 1

1.2 SSR标记 1

1.2.1 SSR标记的原理及主要特点 1

1.2.2 SSR标记在林木方面的的应用及研究状况 2

1.3本试验目的及意义 3

2 材料与方法 3

2.1 试验材料 3

2.2 试验方法 3

2.2.1 DNA的提取及纯化 3

2.2.2 PCR产物的检测 4

2.2.3 SSR-PCR反应条件的优化 5

3 结果与分析 8

3.1 PCR体系的优化 8

3.1.1 正交试验 8

3.1.2 单因素试验 8

3.1.3 小结 9

3.2 引物筛选 10

3.2.1 引物筛选图例 10

3.2.2 退火温度确定 10

4 结论与讨论 13

4.1 结论 13

4.2 讨论 13

柳杉SSR引物的筛选及反应体系的优化

1文献综述

1.1柳杉的概况

1.1.1生物学特征

柳杉（Cryptomeria fortunei）是常绿乔木。叶螺旋状着生，呈5列排列，钻形，两侧扁，长1cm~1.5cm，微向两侧弯曲，基部下延。雌雄同株。雄球花矩圆形，单生叶腋，并近枝项集生。雌球花单生枝顶，近球形，每株鳞常具2胚珠，苞鳞与珠鳞合生，仅先端分离。球果近球形，直径1.2cm~2cm;种鳞约20，楯形，木质，上部肥厚，先端常具5尖~6尖齿，背面有1三角形突起(即苞鳞的先端)，每种鳞有两种子。种子微扁，周围具窄翅^[1]。

1.1.2分布

柳杉作为温性针叶林与杉木(暖性针叶林)比较而言，属于气温较冷的森林带，应该分布在温带针阔混交林带、暖温带落叶阔叶林和亚热带常绿阔叶林中，而在此地带恰恰没有地带性天然分布，反而在南亚热带地区的山地部分有分布。分布在我国的柳杉大多是天然林，林分结构复杂，加之分布地区的不连续性，使得柳杉长期以来基因飘逸收到天然的生态隔离，形成了中间类型少，而生理型、生态型、地理型、形态型多的现象^[2]。

1.1.3经济价值

柳杉既是高山速生用材树种，又是优良的庭园观赏树种，为中国珍贵用材树种之一。柳杉生长迅速，寿命长，用途广，重量轻，收缩小，纹理通直，不翘裂，有着不错的胶粘性和比较简单的耐腐处理，在建筑，桥梁，家具，农具等有着较为广泛的应用。而且，柳杉形态高大，树姿雄伟，优美，因而是优秀的园林风景树种，而且能够净化空气，改善环境卫生。柳杉经济价值主要表现在如下几个方面。

（1）园林用途。柳杉是常绿乔木，树姿秀丽，纤枝略垂，孤植、群植均极为美观， 是一个良好的绿化和环保树种。庭荫树，公园或作行道树。材质轻软，纹理直，结构细，加工略差于杉木，可供建筑、桥梁、造船、造纸等用；枝叶和木材加工时的废料，可蒸馏芳香泊；树皮入药，治癣疮；也可提制栲胶；并作绿化观赏树种 。

（2)工业用材。柳杉树冠高大，树干通直；木材纹理直，材质轻软，结构粗，重要材用树种。

1.2 SSR标记

1.2.1 SSR标记原理及主要特点

因为基因组中某特定的微卫星的侧翼序列一般都是保守性较强的单一序列，所以能够将微卫星侧翼的DNA片段进行克隆和测序，再根据微卫星的侧翼序列就能够人工合成引物来进行PCR的扩增，于是将单个微卫星位点扩增出来。而且因为单个微卫星位点的重复单元在数量上的变异，由于个体的扩增产物在长度上的变化就产生了长度的多态性，这种多态性就称为简单序列重复长度多态性，每个扩增位点就代表了这一位点的一对等位基因。因为SSR重复数目变化巨大， SSR标记因而能够 揭示比RFLP高很多的多态性^[3-5]。

SSR标记具有的主要优点：①数量丰富，均匀、随机、广泛地分布于植物基因组中，覆盖整个基因组；②每个位点都有诸多的等位形式，多态性广泛，信息的含量高；③以孟德尔方式遗传，为共显性，可以鉴别出纯合基因型和杂合基因型。能够揭示等位位点的差异，而且可提供单位位点上较为全面的遗传信息；④能够方便地使用PCR技术进行分析，对DNA质量要求低，用量少，不需要使用同位素，即使是些已经部分降解的样品也同样能用作分析；⑤实验程序简易、所需时间较短，结果重复性好；⑥每个位点由引物序列顺序来决定，便于实验室之间交换数据。

主要缺点：①开发SSR引物所需成本较高、难度也稍大；②现有的SSR标记数量有限，不能标记所有的功能基因，不能构建饱和的SSR遗传图谱；③SSR多态性的检测和应用很大程度上依赖PCR扩增的效果；④SSR座位突变率高，对变异反应非常敏感等等^[6，7]。

1.2.2 SSR标记在林木方面的的应用及研究状况

由于SSR标记具有诸多优点，使得其在林木方面，构建遗传图谱、遗传多样性方面得以广泛应用。

在构建遗传图谱方面：由于SSR是共显性标记，多态性高，适宜构建高密度的遗传图谱。自Roder等^[8]发表了第1张含279个微卫星位点的小麦微卫星图谱以来，至今己建立了多个微卫星图谱。2002年Susan等^[9]把水稻中120个SSR整合到现有的RFLP遗传图谱上，这些SSR分布在水稻全部12条染色体上，已经完成2240个SSR组成的遗传图谱，并初步完成与RFLP图谱的整合工作。

遗传多样性是植物多样性的重要组成部分，蕴藏在植物的整个基因组中。利用SSR标记，结合相关分析、聚类分析等数量遗传分析手段，可以对作物进行分类，判断亲缘关系，是确定其遗传差异的有效方法。如高洁等^[10]利用SSR分子标记对羽叶金合欢(Acacia pennata)的野生种和栽培种进行了分析，利用改良的CTAB方法优化了其总DNA的提取方法，并优化了PCR扩增条件。从已有的金合欢属植物的82对SSR引物中筛选出多态性高，稳定性好的12对引物作为金合欢的SSR分析引物，为进一步对其进行遗传多样性研究提供了依据。如孙亚光等^[11]利用SSR分子标记研究了鹅掌楸实验群体内个体的雄性繁殖适合度。结果表明了交配距离、性选择倾向在鹅掌楸个体的雄性繁殖适合度中扮演重要角色。如徐小林等^[12]利用SSR研究了我国4个省的5个栓皮栎（Quercus variabilis BI）天然群体的遗传多样性。16对SSR标记表现出栓皮栎遗传多样性的丰富：等位基因数（A）平均为8.4375个，有效等位基因数（N_e）平均为5.9512个，平均期望杂合度（H_e）为0.8059，Nei多样性指数（h）为0.8041。栓皮栎的自然分布区中心地带中的群体有着丰富的遗传多样性，但是人为对森林的破坏会降低林木群体的遗传多样性。对于栓皮栎群体的变异，其主要来源为群体中，群体之间分化不大，遗传分化系数也仅仅为0.0455。此外，栓皮栎群体之间的遗传距离和地理距离之间有着很明显的正相关。上面这些遗传信息从而给栓皮栎遗传多样性的保护以及利用提供了依据。如韩国辉等^[13]用柑橘幼苗微量叶片(3~5mg)为材料，改进了柑橘基因组DNA提取方法，并对3种PAGE凝胶浓度和3种银染色方法进行了筛选和优化，由此建立出一种高效而经济的柑橘苗期SSR分析体系。对两个柑橘杂交幼苗群体进行了初步的遗传鉴定分析，用2对引物从24株强德勒柚与沙田柚的杂交幼苗中鉴定出了17株杂种，4对引物在沙田柚与红江橙杂交群体中扩增出了14条多态性条带，占总条带数的70.0%，由此所建立的SSR优化体系能够为柑橘分子辅助育种提供技术手段。

1.3本试验目的及意义