摘 要

近年来的研究结果表明miRNA参与了细菌、真菌和病毒侵染植物的过程， miRNA在植物抗病中的研究越来越受到人们的重视。许多研究结果表明miRNA156在火炬松、烟草、拟南芥以及玉米中，其表达与病原菌侵染密切相关。为了研究miRNA156在杨树与病原菌互作过程中分子机制，本研究以毛果杨全基因组DNA为材料，预测miRNA156启动子的大概区域，设计特异性PCR引物，克隆了miRNA156上游启动子区500bp、1000bp和1500bp片段，分别构建了绿色荧光蛋白（GFP）报告基因植物表达载体。最后通过原生质体的瞬时表达体系对其进行了活性检测，结果表明1500bp片段活性最高，1000bp片段次之，500bp片段活性最低。本研究为进一步将该启动子转入植物，并研究其表达模式、调控机制奠定基础。

关键词：杨树miRNA156; 启动子; 报告基因; 瞬时表达

Abstract

Recent research findings show that miRNAs are involved in plant defense and bacterial ,fungal and viral offense systems. And many results show that the experssion of miRNA156 is intently related with pathogens infection in Loblolly pine, tobacco, Arabidopsis and maize. For understanding the interaction mechanism between miRNA156 and poplar. We predicted microRNA promoter region and cloned three upstreaming fragments of miRNA156, 500bp, 1000bp and 1500bp respectively from Populus trichocarpa. Then plant expression vectors, pMDC83, were constructed and transferred into poplar protoplasts. Fluorescence results showed that they all can drove GFP gene expression. So based on this result, we can transfer thses fragments into plants and study miRNA156 expresson patterns and regulation mechanism in the future.

Key Words：Poplar microRNA156; promoter; reporter gene; transient expression

目录

前言 1

1.文献综述 1

1.1 microRNA（miRNA） 1

1.1.1 microRNA的概念 1

1.1.2 microRNA的生物合成 1

1.1.4 microRNA与病毒的相互作用 2

1.2启动子 3

1.2.1启动子概念 3

1.2.2启动子序列克隆的方法 3

1.2.2.1基因组文库筛选法 3

1.2.2.2启动子探针载体筛选法 3

1.2.2.3反向PCR法 4

1.2.2.4锅柄PCR法 4

1.2.2.5序列特异性引物PCR法 4

1.2.2.6热不对称交错式PCR法 4

1.2.2.7 Y型接头扩增法 4

1.2.3植物逆境相关启动子 5

1.3本论文的研究目的 5

2.材料与方法 5

2.1实验材料 5

2.1.1材料 5

2.1.2仪器与设备 6

2.1.3使用试剂及有关溶液的配方 6

2.1.4载体（图） 6

2.2寻找杨树microRNA156启动子的候选基因 7

2.3杨树microRNA156启动子的克隆 7

2.3.1PCR扩增启动子序列 7

2.3.2 PCR产物加A尾 8

2.3.3目的基因与克隆载体的连接 8

2.3.4大肠杆菌细胞的转化 9

2.3.5目的基因的鉴定 9

2.4启动子分析 9

2.5植物表达载体的构建 10

2.5.1双酶切反应 10

2.5.2目的基因与载体连接 10

2.6原生质体的分离和纯化 10

2.7 PEG介导的原生质体转化与培养 11

3.结果与分析 11

3.1启动子克隆 11

3.2启动子分析 12

3.3原生质体转化载体的构建 16

3.4杨树原生质体瞬时表达 17

4.讨论 18

致谢 20

参考文献 21

前言

生物在生长发育中根据自身和环境定时、定位、定量地表达特定基因, 这种能力是通过生物的DNA顺式作用元件与反式作用因子或环境中的热、光等因素的互作来实现的, 其中, 启动子的作用尤为关键。研究启动子功能对于了解生物生长发育、探讨生物适应环境的机制及实现外源基因在转基因生物中的高效表达等均有重要意义。

近年来的研究结果表明miRNA参与了细菌、真菌和病毒侵染植物的过程，miRNA在植物抗病中的研究越来越受到人们的重视。许多研究结果表明miRNA156在火炬松、烟草、拟南芥以及玉米种，其表达与病原菌侵染密切相关。

为了研究miRNA156在杨树与病原菌互作过程中分子机制，本研究拟克隆杨树miRNA156的启动子并进行报告基因表达载体构建，为进一步将该启动子转入植物，并研究其表达模式、调控机制奠定基础，为将来杨树抗病育种和遗传改良提供理论基础。

1.文献综述

1.1 microRNA（miRNA）

1.1.1 microRNA的概念

microRNA是真核生物中一类自身基因组内的非编码小RNA，长度约为21~25 nt(核苷酸)，与靶基因mRNA结合后起调控作用。对microRNA的研究始于时序调控RNA(stRNA)，自1993年在秀丽新小杆线虫中发现第1个microRNA lin-4以来，研究人员已运用多种检测方法在人类、水稻、拟南芥、秀虫、果蝇、小家鼠等许多生物物种中鉴别出3500余个microRNA。microRNA广泛存在于动物、植物和微生物基因组中，各种生物体基因组中的microRNA基因在数量上约占1%。microRNA主要通过两种机制，即翻译抑制和转录切割，以降低其靶基因编码的蛋白水平，进而在生长、发育、增殖、分化和死亡各个过程中起调控作用^[1]。在植物中，microRNA常与靶基因的编码序列结合，且一般均为完全互补或个别碱基不配对互补，导致切割降解，进一步调控植物的生长发育或其他生理过程。

1.1.2 microRNA的生物合成