摘 要

近年来科学研究表明miRNA可能在植物的抗病过程起到重要作用。许多研究结果表明miRNA164在火炬松、烟草、拟南芥以及玉米种，其表达与病原菌侵染密切相关。

杨树是重要的经济用材树种，而杨树黑斑病是其重要病害之一。本研究以NL895杨为材料，采用实时定量PCR研究杨生褐盘二孢菌侵染后在不同时间点miRNA164的表达谱。并在此基础上克隆杨树miRNA164并利用gateway技术进行植物表达载体构建，为杨树遗传转化提供条件，以及进一步研究杨树miRNA164在杨树与病原菌互作分子机制奠定基础，为将来杨树抗病育种和遗传改良提供理论基础。

关键词：杨树，杨生褐盘二孢菌，miRNA164，植物表达载体

Abstract

Recent researches show that miRNA palys an important role in plant disease-resistance. And many research results also prove that miRNA164 is significantlyy related with fugal infection in Loblolly pine, tobacco, Arabidopsis and maize.

Poplar is one of the most important economic timber species. Marssonina leaf spot disease is a major disease of poplar. In this study, PCR-based transcript quantification was used to test miRNA164 expression pattern at different time point after NL896’s leaves infected with Marssonina brunnea.Then we cloned miRNA164 gene and constructed plant expression vector with Gateway system. Our research provides a foundation for genetic transformation of poplar, theoretical basis for disease resistance breeding and genetic improvement in the future.

Key Words：Poplar, Marssonina brunnea,miRNA164, plant expression vector

目录

前言 1

1.文献综述 1

1.1 miRNA 1

1.1.1 miRNA的发现 1

1.1.2 miRNA的特点 1

1.1.3 miRNA的形成 2

1.1.4 miRNA的机制 2

1.2 miRNA的作用 2

1.2.1抗生物胁迫 2

1.2.2抗非生物胁迫 3

1.2.3生长发育调控 4

1.3 miRNA164 4

2.材料与方法 4

2.1材料准备 4

2.1.1植物材料 4

2.1.2微生物材料 5

2.1.3仪器与设备 6

2.1.4使用试剂及有关溶液的配方 6

2.1.5载体 6

2.2实时定量PCR 8

2.2.1设计引物 8

2.2.2准备实验材料 8

2.2.3总RNA提取与纯化 9

2.2.3.1总RNA的提取 9

2.2.3.2 DNase处理纯化RNA 9

2.2.4 RNA反转录成cDNA 10

2.2.5实时定量 11

2.3目的基因的克隆 11

2.3.1设计引物 11

2.3.2 PCR 12

2.3.3切胶回收 12

2.3.4 PCR产物加A尾 13

2.3.5连T19载体 13

2.3.6菌液PCR 13

2.3.7测序比对 14

2.4入门载体 14

2.4.1入门载体原理 14

2.4.2创建入门克隆（BP反应） 16

2.4.3 LR反应 17

2.4.4菌液PCR 17

3.结果与分析 18

3.1 总RNA提取与纯化 18

3.2 miRNA164实时定量表达谱分析 18

3.3 miRNA164基因克隆 19

3.3.1 PCR克隆miRNA164 19

3.3.2克隆后菌液PCR 19

3.3.3测序验证 20

3.4 miRNA164基因植物表达载体构建 21

4.讨论 22

致谢 23

参考文献 24

前言

近年来科学家在采用Northern Blot和实时定量PCR研究在细菌、真菌和病毒等病原物和非病原物侵染植物的miRNA差异表达谱时，发现一些miRNA被病原物调控，暗示miRNA可能在植物的抗病过程起到重要作用。目前miRNA在植物抗病中的研究越来越受到人们的重视。

杨树是重要的经济用材树种，具有较高的经济环保价值。而杨树病害会严重影响杨树的生长，如由Marssonina属真菌（如杨盘二孢菌）引起的杨树黑斑病，是其重要病害之一，主要危害植株的叶片和叶柄，可导致杨树光合效率下降并提早落叶，严重影响树木的生长量。

1.文献综述

1.1 miRNA

1.1.1 miRNA的发现

1993年首次在线虫中发现miRNA。2002年,miRNA被证实也存在于植物中,随后植物中越来越多的miRNA相继被报道^[1]。miRNA广泛分布于植物基因组中，在基因组上通常具有独立的基因座位，转录产物自身折叠成不完全配对的发卡结构^[2]。

MicroRNAs （miRNAs）是一类内源非编码小RNA （sRNAs ）。在植物中，由初级转录本（pri-miRNA）通过Dicer-like 酶（DCL）加工，形成的长度约 21~24 nt RNAs。miRNA 组装的沉默复合体（RISC ），对互补 mRNA （靶基因）可进行剪切、调控植物生长发育和胁迫应答等过程^[3]。

1.1.2 miRNA的特点