摘 要

本论文采用CTAB-LiCl沉淀首次尝试建立了马尾松总RNA和基因组DNA同时提取方法。提取纯度好、质量高，RNA可用作RT-PCR扩增；基因组DNA可用于SSR扩增。对LiCl沉淀时间比较表明，RNA纯度及浓度随着沉淀时间的延长而提高，沉淀1、3、6、9h所提取的RNA和基因组DNA均适于RT-PCR反应和SSR扩增，电泳检测结果基本无差别。这既节约了实验材料，大大缩短提取时间，又降低了实验成本，不失为一种经济有效的提取方法。

关键词：马尾松；总RNA；基因组DNA；RT-PCR

Meanwhile extraction total RNA and genomic DNA form Pinus massoniana

Abstract

The method of extraction of total RNA and genomic DNA simultaneously using the CTAB-LiCl in Pinus massonian was established for the first time. The extracts have good quality and high purity. RNA can be used for RT-PCR amplification; genomic DNA can be used for the purpose of SSR amplification. In addition, it’s found that the purity and concentration of RNA are positively correlated with the precipitation time of lithium chloride through different precipitation time’s comparison. The result indicates that the total RNA and DNA extracted with the precipitation time of 1, 3, 6 and 9h were all suitable for RT-PCR and SSR amplification, electrophoresis results of segments have non-discrimination. So it can greatly shorten the experimental time and low the cost.

Keywords: Pinus massoniana Lamb; total RNA; genomic DNA; RT-PCR

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目录

前言 1

1文献综述 1

1.1马尾松资源简介 1

1.2植物总RNA和基因组DNA提取方法 1

1.2.1 RNA提取常用方法 1

1.2.2 DNA提取常用方法 2

1.2.3 DNA提取新方法 2

1.3国内外相关研究 2

1.4注意事项与解决要点 3

1.4.1材料的选取与保存 3

1.4.2 RNA酶的处理 3

1.5本研究目的及意义 4

2.材料与方法 4

2.1材料准备 4

2.1.1植物材料 4

2.1.2仪器与设备 4

2.1.3使用试剂及有关溶液的配方 4

2.2试验方法 5

2.2.1总RNA提取与纯化 5

2.2.2 DNA提取与纯化 5

2.2.3紫外吸收测定 6

2.2.4 RT-PCR反应 6

2.2.5 以DNA为模板进行PCR扩增 7

2.2.6电泳制备 8

3结果与分析 8

3.1总RNA提取结果 8

3.1.1紫外分光光度计检测RNA纯度及浓度 8

3.1.2 RNA电泳检测结果 9

3.2 DNA提取结果 9

3.2.1紫外分光光度计检测DNA纯度及浓度 9

3.2.2 DNA电泳检测结果 10

3.3 RT-PCR电泳结果 10

3.3.1 cDNA第一条链电泳结果 10

3.3.2 RT-PCR电泳结果 11

3.3.3 PCR电泳结果 11

4讨论 12

4.1同时提取总RNA和基因组DNA 12

4.2 总RNA和基因组DNA提取质量高 12

4.3适用范围广 13

4.4提取过程中的常见问题 13

4.4.1酚类物质、多糖和蛋白质的影响 13

4.4.2外源物质的污染 13

4.4.3内源物质的污染 14

4.5问题解决 14

5小结 14

致 谢 15

参考文献 16

前言

马尾松是我国南方重要的用材树种，也是荒山造林的先锋树种，其在经济、生态等方面发挥着重要的作用。为了更好的了解其遗传特性，对马尾松进行分子水平上的研究很有必要。一方面，高效提取植物总RNA和基因组DNA是进行Northern印迹、3’RACE、5’RACE以及高质量cDNA文库构建和Sorthern杂交、PCR扩增的首要条件。虽然现在可以利用各种商品化的试剂盒分离植物总RNA和基因组DNA，但试剂盒价格昂贵，对于富含多糖、多酚类次生代谢物等植物也难以满足实验要求。另一方面，在处理转基因的材料或者珍稀物种材料时，如果能从材料中同时提取RNA和DNA，不仅简化了许多实验步骤，减少了与有害物质的接触，而且一次取材可同时提取总RNA和总DNA，既节省植物材料，减少取材过多对活体植物的伤害。因此，寻找一种简单高效的适合对马尾松针叶进行同时提取总RNA和基因组DNA的方法尤为重要。

1文献综述

1.1马尾松资源简介

马尾松（Pinus massoniana Lamb.）为松科（Pinaceae）松属的双维管束松亚属（Subgen. Pinus）常绿乔木，分布极广，一般在长江下游海拔600-700m以下，中游约1200m以上，上游约1500m以下均有分布。马尾松是我国南方重要的工业用材树种，经济价值很高；松木是工农业生产上的重要用材，松香是许多轻、重工业的重要原料；球果可提炼原油；松根可提取松焦油，也可培养贵重的中药材。从该树种的遗传改良被列入国家攻关项目以来，在地理变异和种源选择、种子园建设、造纸材定向选育等领域获得了巨大的成就和进展。

1.2植物总RNA和基因组DNA提取方法

1.2.1 RNA提取常用方法

高效提取植物总RNA是开展现代分子生物学研究的前提。目前对于植物总RNA提取方法很多，概括起来主要有几种：CTAB法^[1]、Trizol法、热硼酸法^[2]、异硫氰酸胍法^[3]。不同方法采用的原理不同，且有各自独特的特点和适用对象。CTAB法是一种常用的提取方法，其中CTAB作为离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使RNA得以游离出来；EDTA以螯合二价金属离子抑制RNA酶的活性，防止RNA降解；Tris-HCl不仅起缓冲作用，还可防止RNA降解；NaC1溶液提供缓冲反应环境。Trizol法即异硫氰酸胍—苯酚法。异硫氰酸胍可以抑制RNA酶、防止RNA的降解，而酚的作用是使蛋白变性。其原理是内含异硫氰酸胍能迅速破碎细胞，同时使核蛋白复合体中的蛋白变性并释放出核酸；由于释放出的DNA和RNA在特定pH值下的溶解度不同，且分别位于中间相和水相，从而使DNA和RNA得到分离；取出水相后，通过有机溶剂(氯仿)抽提及异丙醇沉淀，可得到纯净RNA。热硼酸法(简称HB法)的原理是将硼酸缓冲体系、蛋白酶K消化蛋白和LiC1选择性沉淀RNA等步骤偶联在一起。硼酸可与酚类化合物依靠氢键形成复合物，二硫苏糖醇(DTT)作为还原剂，NP-40可阻止酚类物质氧化，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)可与多酚化合物形成复合体，这些物质都可以抑制植物组织中酚类物质的氧化及其与RNA的结合，通过LiC1沉淀剩余的酚类物质，从而达到与RNA分开的目的。

1.2.2 DNA提取常用方法