摘 要

鸟苷酸激酶（GKs）影响GDP/GMP胞内比例和cGMP的产生，鸟苷酸激酶基因功能与高等植物生殖发育过程密切相关。研究基因的时空表达对阐述该基因的功能有重要意义。本论文利用拟南芥AtGK1基因启动子3个不同长度（2068bp、1522bp、546bp）和GUS融合转基因拟南芥材料进行染色和分析。PBI121-546转基因基因拟南芥仅在花器官的花药部分有GUS基因的少量表达，在叶、花和果实中均检测不到表达；PBI121-1522基因拟南芥在花、叶和果实中均观察不到表达；PBI121-2068基因拟南芥在整个植株的维管组织中都能表达, 叶器官中也主要在维管部位表达；在雄蕊、雌蕊、花药、花丝、花托、萼片等花器中能检测到表达，在角果与果柄连接处观察到较强的表达, 观测到果皮处表达也十分明显。表明AtGK1基因启动子主要调控区集中 1-546bp和1522-2068bp两个区间。

关键词：拟南芥；GKs；启动子；基因表达

Expression of GUS Reporter Gene in Transgenic AtGK1 Gene Plants

ABSTRACT

GKs affects the intracellular proportion of GDP/ GMP and the production of cGMP. The function of GKs gene closely related to the reproductive development of higher plants. The study of the expression of GUS reporter gene is important for elucidating the function of . In this paper, three ddifferent fragment (2068bp, 1522bp, 546bp) of the upstream regulation sequence of AtGK1 gene is cloned. PBI121-546 transgenic gene arabidopsis was expressed only in the anthers of the floral organs , and no expression was found in leaves and fruits. PBI121-1522 gene arabidopsis was not be expressed in flower, leaf and fruit ; PBI121-2068 gene Arabidopsis can be expressed in the whole plant.It is clear that the main regulatory region of the AtGK1 gene promoter was centered at 1-546bp and 1522-2068bp.

Key words：Arabidopsis；GKs gene; promoter;Gene expression.

目 录

1 文献综述 - 1 -

1.1 GUS报告基因产生背景 - 1 -

1.2 GUS活性测定方法 - 1 -

1.2.1　组织化学定位法 - 2 -

1.2.2　分光光度法 - 2 -

1.2.3　荧光分析法 - 3 -

1.2.4　聚丙烯酰胺凝胶电泳原位分析 - 3 -

1.3 报告基因GUS在转基因植物中的表达及GUS蛋白稳性 - 4 -

1.4 GKs基因的简介 - 4 -

2 材料与方法 - 6 -
2.1 前期已构建PBI121-2068/1522/546-GUS表达载体 - 5 -

2.2 拟南芥遗传转化及转基因植物筛选 - 6 -

2.3 GUS组织化学染色 - 6 -
2.3.1 实验原理 - 6 -
2.3.2 药品试剂 - 6 -

2.3.3 实验器材 - 6 -

2.3.4 实验步骤 - 6 -

2.3.5 结果 - 6 -

3 结果 - 7 -
3.1 PBI121-2068/1522/546-GUS表达载体 - 7 -

3.2 GKs基因调控序列指导GUS基因在花中的表达 - 7 -
3.2.1 转PBI121-546基因拟南芥花的表达 - 7 -

3.2.2 转PBI121-1522基因拟南芥花的表达 - 7 -

3.2.3 转PBI121-2068基因拟南芥花的表达 - 8 -

3.3 GKs基因调控序列指导GUS基因在叶中的表达 - 8 -
3.3.1 转PBI121-546基因拟南芥叶的表达 - 8 -

3.3.2 转PBI121-1522基因拟南芥叶的表达 - 8 -

3.3.3 转PBI121-2068基因拟南芥叶的表达 - 9 -

3.4 不同长度GKs基因调控序列启动子元件的GUS表达差异 - 11 -

4 讨 论 - 12 -

4.1 结果分析讨论 - 12 -

4.2 植物学中GUS报告基因优缺点 - 12 -
4.2.1 GUS基因扩散与漂移 - 12 -

4.2.2 GUS基因的多效性 - 14 -

致谢 - 15 -

参考文献 - 16 -

1 文献综述

1.1 GUS报告基因产生背景

使用基因融合来研究现代分子生物学的诸多问题，如基因表达，调控是非常有效的，特别是在植物分子生物学领域。目前，已经开发了至少六种报告基因，如大肠杆菌β-半乳糖苷酶（LazZ），氯霉素乙酰转移酶（CAT），新霉素磷酸转移酶（APH3II，N PTII），胭脂碱合酶（NOS），章鱼胺合成酶（OCS）和萤火虫荧光素酶基因。然而，这些基因具有一些这些或其他缺点，如细胞的内部酶水平高，字高，或分析步骤繁琐，量化困难，或不能进行氨基末端的末端，或酶不稳定等，从而影响其应用范围广泛。更好的基因融合系统要求酶在活体内具有低内在或低活性的酶;容易量化和定位;具有很高的敏感度;可以与其他蛋白质基因融合，并要求其酶反应足够特异性，不是或很少受正常细胞代谢的影响。近年来开发了更好的细菌和植物基因融合系统，即用大肠杆菌β-葡糖苷酸酶基因作为报告基因基因融合系统。

自从Jefferson等首次提出β-葡糖苷酸酶基因GUS可作为植物遗传转化时的报告基因以来，GUS报告基因已成为一种最广泛运用的报告基因。据不完全统计，迄今已获得上千株以GUS为报告基因的转基因植物。它的优势是检测方法简单，灵敏度高。毋庸置疑，作为报告基因的GUS基因在未来几年将在植物基因工程和遗传转化中发挥重要作用。