摘 要

TMM(TOO MANY MOUTH)基因编码富亮氨酸重复受体蛋白，是气孔信号传导过程中的重要调节因子，主要是通过抑制响应定位信号的细胞进行不对称分裂来调控分裂方向。TMM基因功能缺失后，植株叶表皮气孔密度会大幅增加。

本实验以小叶杨为材料，通过同源克隆的方法获得了TMM基因启动子序列，并对其顺式作用元件进行分析，结果表明：该序列含核心启动子元件，如CAAT-box和TATA-box等。还有大量光响应元件，如Box 4、Box I和GT1-motif等；叶形态发育调控元件：HD-Zip2；叶肉细胞分化元件：HD-Zip1等；赤霉素响应元件：GARE-motif和P-box；干旱诱导的MYB结合位点：MBS和抗逆响应顺式作用元件：TC-rich repeatsd等其他元件。这为后续基因表达载体构建和遗传转化的研究、为其表达模式、调控机制的探索奠定基础，为将来杨树抗病育种和遗传改良提供理论基础。

关键词：小叶杨；TMM；启动子克隆

Cloning and Functional Analysis of TMM Gene Promoter from Populus simonii

ABSTRACT

TMM (TOO MANY MOUTH) gene encodes a leucine-rich repeat receptor protein, which is an important regulatory factor in the process of stomatal signal conduction. It mainly regulates the direction of division by suppressing the asymmetric division of the cells that respond to the localization signal. After the lack of TMM gene function, the stomatal density of plant leaf epidermis will increase significantly.

In this study, the promoter sequence of TMM gene was obtained by homologous cloning method, and its cis-acting elements were analyzed. The results showed that the cloned segment contained the core promoter elements such as CAAT-box and TATA-box and so on. There are a lot of light response elements such as Box 4, Box I and GT1-motif, etc.; leaf morphological development elements: HD-Zip2; mesophyll differentiation elements: HD-Zip1 and so on; gibberellins response elements: GARE-motif and P DBC-induced MYB binding sites: MBS and anti-response cis-acting elements: TC-rich repeated and other components. This study will provide a theoretical basis for future breeding and genetic improvement of poplar trees in the future, which will lay the foundation for the study of the expression pattern and mechanism of gene expression.

Key words：Populus simonii；TMM；Promoter cloning

目 录

1 文献综述 - 1 -

1.1 引言 - 1 -

1.2 气孔的发育 - 1 -

1.3 气孔的调控机制 - 1 -

1.3.1 转录因子 - 1 -

1.3.1.1 bHLH型转录因子 - 1 -

1.3.1.2 MYB类转录因子 - 2 -

1.3.1.3 Dof类转录因子 - 2 -

1.3.2 正负调控因子及受体 - 2 -

1.3.3 环境因素 - 4 -

1.4 启动子 - 4 -

1.4.1 启动子克隆的方法 - 4 -

1.4.2 启动子功能分析方法 - 5 -

1.4.2.1 生物信息学法 - 5 -

1.4.2.2 瞬间表达分析 - 5 -

1.4.2.3 转化分析 - 5 -

1.5 研究意义 - 5 -

2 小叶杨TMM基因启动子克隆与功能初步分析 - 7 -

2.1 试验材料 - 7 -

2.1.1 植物材料 - 7 -

2.1.2 菌株与载体 - 7 -

2.1.3 培养基 - 7 -

2.1.4 酶与试剂 - 7 -

2.1.5 主要仪器设备 - 7 -

2.2 试验方法 - 7 -

2.2.1 小叶杨基因组DNA提取 - 8 -

2.2.2 大肠杆菌感受态细胞制备 - 9 -

2.2.3 引物设计 - 9 -

2.2.4 小叶杨TMM基因启动子PCR扩增 - 9 -

2.2.5 琼脂糖凝胶电泳检测与目的片段回收 - 10 -

2.2.6 目的片段连接克隆载体 - 11 -

2.2.7 重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞（冻融法） - 11 -

2.2.8 蓝白斑阳性克隆筛选 - 12 -

2.2.9 重组质粒菌液PCR鉴定、电泳检测与测序 - 12 -

2.2.10 启动子顺式作用元件预测分析 - 13 -

3 试验结果与分析 - 14 -

3.1 小叶杨基因组DNA提取 - 14 -

3.2 小叶杨TMM基因启动子克隆 - 14 -

3.3 TMM基因启动子序列分析 - 19 -

3.3.1 启动子顺式作用元件预测分析 - 19 -

讨 论 - 23 -

致 谢 - 25 -

参考文献 - 26 -

1 文献综述

1.1 引言

气孔是位于植物茎叶等气生器官表面的特殊结构，由一对肾形保卫细胞包围形成。它不仅是植物与外界环境进行气体交换的重要通道，并且植物约90%水是通过气孔蒸腾作用散失。同种植物能生活在不同环境中，气孔的调节起了很大作用。植物通过调节气孔分布和孔径大小，改变光合和蒸腾速率，从而适应环境的变化^[1]。因此，研究气孔形成机理具有重要的意义。

1.2 气孔的发育

气孔起源于发育早期叶片的未分化的表皮细胞，即原表皮细胞。该细胞以一种未知途径转化为拟分生组织母细胞(peristemoid mother cell, MMC)^[2]。MMC以不对称分裂的方式，分化成一个小的三角形的拟分生细胞(meristemoid, M)和一个大的姐妹细胞stomatal lineage ground cell (SLGC)^[3]。MMCs通过不对称分裂的方式，分化形成一个三角形体积较小的拟分生细胞(meristemoid, M)和一个体积较大的姊妹细胞stomatal lineage ground cell (SLGC)；拟分生细胞在进一步的分化前可以进行最多3次不对称分裂，从而扩增细胞系，所以被称为扩增分裂^[4]。最后，拟分生细胞进一步分化成为保卫母细胞(guard mother cells, GMCs)，保卫母细胞对称分裂形成两个肾形保卫细胞( Guard cells，GCs)，从而形成气孔^[5-7]。气孔的分布方式遵循“单细胞间隔法则”，任何两个气孔之间都间隔一个无气孔区域(stomatal-free region)，这个区域相当于一种溶质储存装置，确保保卫细胞与邻近细胞进行水分和离子交换，从而保证气孔的开闭效率，不仅可以避免多余的蒸腾作用，还能确定CO₂吸收与光合作用所需的最佳配比^[8-9]。

1.3 气孔的调控机制