松材线虫在逆境条件下自噬相关基因的表达分析毕业论文

 2021-04-12 11:04

摘 要

松材线虫病对于松类植物极具危害性。然而,目前对于松材线虫的致病机理还不清楚,松材线虫的致病基因及生长发育相关的基因也仍在研究当中。近年来,细胞自噬由于其在进化中的高度保守性而备受关注。对松材线虫自噬相关基因的克隆及其在逆境条件下的分析可为其功能研究奠定基础。为此,本研究对松材线虫自噬基因BxAtg7BxAtg4.1进行了克隆,并在温度变化、氧化胁迫时对BxAtg7BxAtg4.1这两个基因的表达进行分析。结果表明,在温度逆境下,BxAtg7基因在强毒虫株中的表达量变化不大,但在4℃时最高;弱毒虫株的BxAtg7表达量随温度变化波动强烈,在4℃和35℃的温度下比25℃线虫最适温度时高,并在35℃时表达量最高。BxAtg4.1基因在强毒虫株中在4℃、35℃和40℃时表达量均高于25℃最适温度时,在4℃时自噬表达量最高;弱毒虫株自噬表达量在4℃时最高,在35℃和40℃时变化不大。说明低温和高温时松材线虫可启动细胞自噬,以应对艰难的环境。测定还表明,随着H2O2浓度的升高,松材线虫这两个细胞自噬基因的表达量先升高后降低,说明松材线虫可通过细胞自噬来适应氧化胁迫的环境,强毒虫株AmA3的两个自噬基因在H2O2浓度为15mM时表达量最高,弱毒虫株Yw4在H2O2浓度20mM时表达量最高,且强毒虫株的表达量远高于弱毒虫株,说明强毒虫株对氧化胁迫的抗逆反应较弱毒虫株敏感。研究结果为进一步揭示松材线虫的致病机理提供了参考依据。

关键词:松材线虫;细胞自噬;自噬基因;逆境胁迫

Expression analysis of pine wood nematode under adverse conditions of autophagy related genes

Abstract

Pine wilt disease is very harmful for conifers. However, the pathogenic mechanism of pine wood nematode is unclear, pine wood nematode pathogenic gene and growth related genes are still under study. In recent years, autophagy has attracted much attention because of its high conservation in evolution. Cloning of PWN autophagy related genes and analysis under abiotic stress conditions can lay the foundation for the study of the function of. Therefore, this study of pine wood nematode autophagy gene BxAtg7 and BxAtg4.1 of the clone, and analyzed in temperature changes, oxidative stress of the two genes and BxAtg4.1 BxAtg7 expression. The results show that under temperature stress, gene BxAtg7 in strong poisonous plant expression volume changed little, but at 4℃, the highest; weak poisonous plants BxAtg7 expression amount to change with the fluctuations in temperature strongly, in 4℃and 35℃ than 25℃ elegans optimum temperature at high and at 35℃table up to the amount of the highest. Gene BxAtg4.1 in strong poisonous lines at 4℃, 35℃ and 40℃ expression were higher than 25℃, the optimal temperature. At 4℃ when autophagy quantity highest attenuative strain autophagy expression amount at 4℃, the highest at 35℃and 40℃changed little. Explain the low temperature and high temperature when the autophagy was initiated to cope with the difficult environment. With the increase of the concentration of H2O2, Bursaphelenchus xylophilus autophagy gene expression increased at first and then decreased, pine wood nematode can adapt to environmental oxidative stress by autophagy. Two genes autophagy for strong poisonous line AmA3 in H2O2 concentration is 15mM expression was the highest, and weak poisonous plant Yw4 in H2O2 concentration of 20 mM expression was the highest, and strong poisonous plant expression is much higher than the attenuative strain that strong poisonous insect strains on oxidative stress of anti inverse response is weaker in the insect sensitive strains. The research results provide a reference to further reveal the pathogenic mechanism of pine wood nematode.

Key words:Bursaphelenchus xylophilus; cell autophagy; autophagy; coercion

目 录

1 绪 论 - 1 -

1.1 松材线虫病研究概况 - 1 -

1.2 细胞自噬研究进展 - 2 -

1.2.1 细胞自噬的定义 - 2 -

1.2.2 细胞自噬的分类 - 3 -

1.2.3 细胞自噬的过程 - 3 -

1.2.4 细胞自噬的生理功能 - 3 -

1.2.5 细胞自噬在真菌和植物中的研究 - 5 -

1.2.6 细胞自噬在模式生物秀丽隐杆线虫中的研究进展 - 6 -

1.3 细胞自噬与松材线虫生存和致病性关系的思考 - 8 -

2 材料与方法 - 9 -

2.1 供试松材线虫及培养 - 9 -

2.2 松材线虫总RNA的提取 - 9 -

2.3 松材线虫cDNA的合成 - 9 -

2.4 松材线虫自噬基因BxAtg7 BxAtg4.1 的获得 - 9 -

2.5 qRT-PCR测定不同毒力松材线虫在温度和H2O2胁迫下的表达量 - 10 -

3 结果与分析 - 12 -

3.1 松材线虫总RNA的质量分析 - 12 -

3.2 松材线虫自噬基因BxAtg7BxAtg4.1的获得 - 12 -

3.3 松材线虫BxATG-7BxATG-4.1基因PCR产物测序结果及分析 - 13 -

3.3.1 松材线虫BxATG-7基因PCR产物测序结果及分析 - 14 -

3.3.2 松材线虫BxATG-4.1基因PCR产物测序结果及分析 - 14 -

3.4 不同毒力松材线虫自噬基因BxAtg7BxAtg4.1对温度的响应与表达量 - 15 -

3.5 不同毒力松材线虫自噬基因BxAtg7BxAtg4.1在氧化胁迫时的表达量分析 - 16 -

结 论 - 18 -

致 谢 - 19 -

参考文献 - 20 -

1 绪 论

1.1 松材线虫病研究概况

松材线虫病(Bursaphelenchus xylophilus)又名松树萎蔫病,是松树的一种毁灭性病害。在中国,它的主要传播媒介昆虫是松墨天牛(Monochamus alternatus Hope)。松材线虫的致病力强,传播快,寄主死亡速度快;一旦发生,治理难度极大。该病不仅给国民经济带来了巨大的损失,也破坏了自然景观及生态环境,严重威胁到我国丰富的松林资源(Xie,2015)。

松材线虫在分类上属线形动物门线虫纲,成虫长约1mm左右,雌雄同型,蠕虫状,其形态需在高倍显微镜下才能观察清楚。

危害症状:松墨天牛补充营养时,将松材线虫携带至健康松树并侵染木质部。松材线虫寄生在木质部树脂道中,在大量繁殖的同时移动扩散逐渐遍及整株松树,破坏了树脂道薄壁细胞和上皮细胞,造成植株失水,降低和停止了蒸腾作用。外部表现症状为:针叶逐渐变为黄褐色乃至红褐色,萎蔫最后枯死。病害发展过程分4个阶段:(1)外观正常,树脂分泌减少,蒸腾作用下降,嫩枝上可以看到天牛啃食树皮的痕迹;(2)针叶开始变色,树脂分泌停止,除了看见天牛补充营养痕迹外,还可以发现天牛产卵刻槽以及其它甲虫侵害的痕迹;(3)大部分针叶变为黄褐色,萎蔫,可以看到到天牛及其它甲虫的蛀屑;(4)针叶全部变为黄褐色至红褐色,病树整株干枯死亡。此时树体一般有许多次期害虫栖居(Wang,2012)。

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