摘 要

论文目的是构建鸟苷酸激酶AtGK1的真核表达载体。首先提取拟南芥的总RNA,再根据已知的拟南芥鸟苷酸激酶的序列设计引物，进行反转录PCR PCR产物进行TA克隆，经过蓝白斑筛选，菌裂解PCR以及质粒测序，选出含有目的片段的质粒进行酶切，用DNA连接酶将酶切处理的pPICZA质粒和酶切的TA克隆的质粒进行酶连，然后转化到大肠杆菌的感受态细胞中。挑选单克隆菌株进行菌裂解PCR并提取重组质粒进行酶切验证。

关键词：拟南芥；鸟苷酸激酶；pPICZA；真核表达载体构建

Construction of eukaryotic expression vector for Guanosine monophosphate kinase AtGK1

ABSTRACT

Aim of this paper is to construct the guanosine monophosphate kinase AtGK1 eukaryotic expression vector. The first step is to extract total RNA from Arabidopsis thaliana according to the known sequence of guanylic acid kinase gene AtGK1, and to design primers and then to operate RT-PCR using cDNA as the template. The target sequence is cloned through blue white spot screening and enzyme digestion. pPICZA plasmid is cut with appropriate enzymes and inserted target fragment and then transformed into the E. coli; The positive clones were identified with PCR and then enzyme validation.

Key words：Arabidopsis thaliana; Guanosine monophosphate kinase; pPICZA; Eukaryotic expression vector

目 录

1 前 言 5

1.1 鸟苷酸激酶 5

1.2 拟南芥 5

1.3 真核表达载体构建 6

2 材料与方法 7

2.1 实验材料 7

2.1.1 菌株 7

2.1.2 植物材料 7

2.1.3 质粒 7

2.1.3.1 pPICZA 7

2.1.3.2 pEASY-Blunt3 8

2.1.3 试剂 9

2.1.3.1常规药品 9

2.1.3.2抗生素 9

2.1.4主要仪器 10

2.1.5 培养基 11

2.1.5.1 MS培养基（g/L） 11

2.1.5.2 低盐LB培养基（g/L） 11

2.1.6 限制性内切酶 11

2.1.7 商业试剂盒 12

2.2 实验方法 13

2.2.1 拟南芥的培养 13

2.2.1.1种子的处理 13

2.2.1.2土的处理 13

2.2.1.3移苗 13

2.2.1.5日常管理 14

2.2.2 拟南芥总 RNA提取方法 14

2.2.2.1 拟南芥总RNA提取方法原理 14

2.2.2.2 拟南芥总RNA提取方法操作步骤 15

2.2.3 琼脂糖凝胶电泳 15

2.2.3.1 琼脂糖凝胶电的原理 15

2.2.3.2 琼脂糖凝胶电的操作流程 16

2.2.4 引物设计 16

2.2.5 大肠杆菌转化 17

2.2.6 革兰氏阴性杆菌质粒提取方法 17

3.1 TA克隆 19

3.1.1拟南芥总 RNA提取 19

4 讨论 24

参考文献 25

致 谢 26

1 前 言

1.1 鸟苷酸激酶

鸟苷酸及其代谢衍生物是胞内核酸合成的底物，也是重要的信号分子。鸟苷酸（GMP）通过鸟苷酸激酶（GKs）和核苷二磷酸激酶 （NDK）催化，分别产生二磷酸鸟苷（GDP）和三磷酸鸟苷（GTP），GTP在鸟苷酸环化酶（GC）催化下，生成胞内重要的信号分子环化鸟苷酸（cGMP）。GKs直接影响GDP/GMP胞内比例，进而影响cGMP的产生。在原核生物、低等真核生物和节枝动物中，GKs非常保守，突变致死。

1.2 拟南芥

拟南芥 拉丁名：Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.十字花科，鼠耳芥属，拟南芥，又名鼠耳芥、阿拉伯芥、阿拉伯草。这种小小的有花植物，是在植物科学，包括遗传学和植物发育研究中的模式生物之一。其在植物学中所扮演的角色正仿佛小白鼠在医学和果蝇在遗传学中的一样。 目前发现的拟南芥共有 750 多个生态型，这些生态型的拟南芥在形态发育，生理反应方面有着相当大的差异。作为模式植物的拟南芥在实验室中最为常见的三种生态型分别是 Landsberg erecta(Ler)、 Columbia(Col)、Wassilewskija(Ws)，其中 Col 生态型用于拟南芥的全基因组测序，Landsberg erecta 是另外一种生态型 Landsberg 的 erecta 基因缺失的突变体。

图1 拟南芥CoL-0(Columbia)型

Figure 1 Arabidopsis thaliana Col-0 (Columbia)

1.3 真核表达载体构建

载体构建(vectorconstruction)是分子生物学研究常用的手段之一。载体构建即是构建含外源DNA的质粒。主要包括已有载体多克隆位点MCS的改造和已有载体启动子、增强子、筛选标记等功能元件的改造。载体构建完成后可利用PCR原理进行测序验证。质粒运载体的最大插入片段约为10 kb(kb表示为千碱基对)。人工构建的质粒可以集多种有用的特征于一体，如含多种单一酶切位点、抗生素耐药性等。常用的人工质粒运载体有pBR322、pSC101。

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 菌株

大肠杆菌DH5α，购于北京全式金生物技术有限公司。

2.1.2 植物材料

拟南芥，实验室储存。

2.1.3 质粒

2.1.3.1 pPICZA

pPICZα A，B和C是3.6 kb的毕赤酵母蛋白分泌表达载体。表达的重组蛋白是融合蛋白，含有一个N-端多肽，编码酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）α-因子分泌信号，质粒图谱如图1所示。载体能够在毕赤酵母中利用甲醇诱导的高水 平的表达目的蛋白，并且可以用在任何毕赤酵母中，包括X33，GS115菌株，SMD1168H，KM71H。pPICZα  A载体包含以下元素：5'端含有AOX1启动子的严格调控，利用甲醇诱导表达任何感兴趣的基因；α-因子分泌信号能够分泌性表达目的蛋白；Zeocin抗性基因在大肠杆菌和毕赤酵母都能用于筛选；C-端含Myc和His标签，可以用于检测和纯化重组蛋白；pPICZ A读码框使得可以将基因克隆入载体而不发生任何移码突变。

图2 质粒pPICZ A