摘 要

柳杉(Cryptomeria fortunei)是较好园林风景树种，也是重要的速生用材和生态造林树种。本文通过Illumina Hiseq测序平台对4个不同发育阶段的柳杉维管形成层进行转录组测序，对测序得到的数据进行总体分析，为后续进行的木材形成有关基因调控研究提供理论基础。结果如下：

（1）测序数据参照无参转录组测序流程进行分析，一共产生105.9Gb的数据，过滤后clean reads都达到90%以上。Clean reads经Trinity软件进行组装，一共产生64,969个Unigene（29,381 contigs 35,588 singletons），总长度为83,003,836bp。将Unigene利用BLAST算法与七大功能数据库（NR, NT, GO, COG, KEGG, Swissprot, Interpro）进行比对，共有42,914个Unigene得到注释，占总Unigene的66.05%。

（2）GO注释共有89,644个转录本得到注释。对GO注释转录本进行分类，其中有38,432个转录本（42.87%）注释为生物过程，有32,749个转录本（36.53%）注释为细胞组分，有18,463个转录本（20.6%）注释为分子功能。而KEGG注释有31,580个Unigene得到注释。分为6大类。另有37,762个Unigene得到COG注释，被分为25类，其中注释数目最多的类型是全局功能预测，占总数的16.9%；其次是转录，比例是8.8%；再其次是复制、重组及修复，占总数的7.8%。

关键词：柳杉；形成层；转录组测序

Sequencing and analysis of the transcriptome of different developmental stages in cambium of Cryptomeria fortunei

ABSTRACT

Cryptomeria. fortunei is not only a good landscape tree species, but also an important fast-growing wood and ecological forestation species. In this paper, C. fortunei has been used as experimental materials for research. The development of C. fortunei stem and vascular cambium were observed through the paraffin sections in morphology. In this study, we conducted the transcriptome sequences of the C. fortunei vascular cambium at four different development stages based on Illumina Hiseq sequencing platform. The datas and the differences were analysed, which provided the theoretical basis for the further study of the genetic regulation of wood formation. The results were as follows:

（1）The sequencing data was analyzed according to the no-reference transcriptome sequencing procedure and in total 105.9G data was obtained, and the clean reads reached more than 90% after filtering. Clean reads were assembled using Trinity software and 64,969 Unigenes(29381contigs and 35588singles) were obtained. The total length were 83,003,836bp.42,914 Unigenes(accounted for 66.05% of the total Unigenes) were functionally annotated after all Unigenes aligned with seven functional databases(NR, NT, GO, COG, KEGG, Swissprot, Interpro)by using BLAST software.

（2）GO annotation showed that 89,644 transcripts were divided into 3 groups, which contained Biological Process（38,432 transcripts, accounted for 42.87%）、Cellular Component(32,749 transcripts, accounted for 36.53%）Molecular Function(18,463 transcripts, accounted for 20.6%)。And 31,580 Unigenes were annotated in KEGG database. In addition, 37,762 Unigenes were annotated in COG database, which were divided into 25 groups. In these groups, the General function prediction only group (accounted for16.9%) is biggest, the second one was Transcription(accounted for8.8%),the third one was replication, recombination and repair(accounted for7.8%).

Key words: Cryptomeria fortunei; cambium; transcriptome sequencing;

目 录

第一章 文献综述 1

1.1 柳杉的概况 1

1.2 木材的形成 1

1.2.1 木材形成的生物学过程 1

1.2.2 木材形成的分子生物学研究 2

1.3 转录组技术的发展 2

1.3.1 第一代测序技术 3

1.3.2 第二代测序技术 3

1.3.3 第三代测序技术 3

1.4 转录组测序在林木遗传改良中的应用 3

1.5 柳杉的生物学研究状况 4

1.6 本文研究的目的及意义 4

第二章 转录组测序及分析 5

2.1 材料及方法 5

2.1.1 实验材料 5

2.1.2 RNA提取、文库制备、测序 5

2.1.2.1 RNA提取及纯化 5

2.1.2.2 总RNA纯化 6

2.1.2.3 文库的制备及测序 6

2.1.3 数据过滤 7

2.1.4 数据组装及注释 7

2.1.5 Unigene中特异结构的预测 8

2.2 结果与分析 9

2.2.1 RNA提取结果 9

2.2.2 柳杉维管形成层转录组数据过滤及组装 9

2.2.2 柳杉维管形成层转录组功能注释及分类 11

2.2.2.1 Unigene的KEGG代谢通路分析 12

2.2.2.2 Unigene的GO功能分析 13

2.2.2.3 Unigene的COG功能分析 14

2.2.3 柳杉维管形成层转录组Unigene结构预测 15

2.2.3.1 CDS预测 15

2.2.3.2 TF编码能力预测 15

2.2.3.3 SSR预测 16

2.2.3.4 SNP预测 17

2.3结论与讨论 17

结 论 19

致 谢 20

参考文献 21

第一章 文献综述

1.1 柳杉的概况

柳杉，乔木，树皮红棕色，纤维状，裂成长条片脱落；大枝近轮生，平展或斜展；小枝细长，常下垂，绿色，枝条中部的叶较长，常向两端逐渐变短。球果圆球形或扁球形，生长快，产量高。柳杉常与其他阔叶林混生，适生于温暖湿润气候，尤其需要空气湿度大，夏季比较凉爽的海洋性或山区气候。是一个良好的绿化和环保树种。材质轻软，纹理直，结构细，加工略差于杉木，可供建筑、桥梁、造船、造纸等用；枝叶和木材加工时的废料，可蒸馏芳香泊；树皮入药；也可提制栲胶；并作绿化观赏树种。中国柳杉为中国特有树种，分布于长江流域以南至广东、广西等地。在江苏南部、浙江、安徽南部、河南、湖北、湖南、四川、贵州、云南、广西及广东等地均有栽培。

1.2 木材的形成

1.2.1 木材形成的生物学过程

木材是通过维管形成层的细胞分裂、新生木质部细胞的成熟、成熟木质部的蓄积等三个过程形成的，即可见木质部的直接起源为维管形成层。形成层是一个连续的鞘状层，包围在整个树干、树质部。赵西平^[1]运用木材解剖图像分析系统和显微枝、树根的次生木质部周围，属分生组织。它向外产生次生韧皮部，向内分化产生次生木照相的方法对蒙古栎次生木质部的解剖结构进行观察分析，证实其次生木质部由导管、环管管胞、木纤维木射线及轴向薄壁细胞组成。

形成层分化次生韧皮部与次生木质部有明显的内在节奏规律，也受外界环境影响。温 带树木的形成层，在春天开始活动。形成层细胞在平行于圆周的分裂（平周分裂）中，向内 和向外分裂出次生木质部母细胞和次生韧皮部母细胞的速率不一样。向内分化出的次生木质 部母细胞，一般要进行多次分裂以后，才形成各种木质部。而每个次生韧皮部母细胞则 只分裂一、二次，就形成了韧皮部。因此，在一个生长季中，次生木质部的产生数量远远超过了次生韧皮部。冬季形成层原始细胞处于休眠状态，到了次年春季又开始活动， 以此年复一年。因此，温带树木的次生木质部（木材）中，由于这种季节性的生长，在茎的横断面上可显出同心环状的生长轮（年轮）。热带树木，只有生长在旱季与雨季交替的地区，形成年轮，而在四季气候差不多的地区，年轮较少形成。不同种类的植物，形成层的活动不完全相同。许多松柏类树木的形成层活动,常比双子叶植物树木的持续时间要长。形成层细胞的分裂活动，通常可持续几个月。彭冶^[2]通过对维管形成层发育的解剖学观察发现杉木芽的萌动一般是在 2 月下旬，其维管形成层于3月初启动，经过一个月的缓慢生长，至4月下旬进入分裂旺盛期。郭明辉^[3]主要研究了红松人工林木材解剖特征与气象因子的关系，结果表明：管胞长度随温度增加而增加，相关程度达显著水平；管胞径向直径与降水量、日照呈显著正相关，与温度呈显著负相关；管胞径与弦向壁厚和温度与相对湿度呈显著正相关；胞壁率与温度呈显著正相关；纤丝角与日照呈正相关、与温度呈负相关。

1.2.2 木材形成的分子生物学研究

木材具有复杂的生物学特征，并最终展现出优劣不易的表现与品质。传统的木材科学研究，主要集中在立木采伐后的加工利用方面，尽可能发挥木材的优良特性并抑制其缺陷，但是这种筛选成本高且工作时间长。因此利用分子生物学技术是研究木质部发育形成的最佳实验系统。基因组学，从生物体所有遗传信息着手，从整体水平上测定全部核酸、蛋白质、糖类等生物分子复合体的一级结构，计算或模拟其空间结构，并在细胞中定位，以便确定在各种生物代谢途径、生理途径、信号传导中系统水平的分子结构图，从而在整体水平进行生化分析和遗传分析的一种方法。采用表达序列签(EST）测序技术，对其进行基因作图，并可用于重要材性性状定位分析和图谱克隆。