摘 要

开花时间是植物的一个重要性状，也是植物生长发育中一个非常重要的事件。经过多年的研究，人们发现成花素是一种由FT基因所编码的蛋白质。近年来，科学家们已经在水稻、小麦、葫芦、番茄、柑橘等其他植物中都克隆到了FT的同源基因，并对部分植物进行了遗传转化，转基因植物中，FT类基因的过量表达均在不同程度上引起了转基因植株的提早开花。但研究表明，采用组成型强启动子，如35S,会导致花粉不育。而采用诱导型启动子能精确地调控FT基因的关闭与开放，是解决这一问题的可能途径之一。

因此，本研究主要将小叶杨PsFT1基因通过LR反应构建植物DEX诱导性表达载体pTA7001- PsFT1，并且利用液氮冻融法将构建好的pTA7001- PsFT1转入农杆菌感受态细胞。采用农杆菌转化法进行烟草和T89杨的遗传转化，以期获得有效调控FT基因表达，提早开花，并且育性正常的转基因杨树，为杨树的遗传改良奠定基础。

关键词：小叶杨；PsFT1；植物表达载体；遗传转化

Expression vector construction of plant induced by DEX and genetic transformation of the PsFT1 gene of Populus simonii

ABSTRACT

Blossom time is one of the most important traits in plants, and it is also a very important event in the development of plant growth. After years of research, people found that florigen is a protein encoded by FT gene. In recent years, scientists have cloned FT homologous in rice, wheat, gourd, tomato, citrus and other plants, and genetic transformation has been carried out in some plants, in those transgenic plants, over expression of FT gene cause transgenic plants blossom early in different extent. But some researches also show that, the strong constitutive promoter, such as 35S, will cause the pollen sterility. But the use of inducible promoters can accurately regulate the close and open of the FT gene, which is one of the possible ways to solve this problem.

Therefore, this study we cloned PsFT1 gene of Populus simonii by LR reaction into a plant expression vector, pTA7001- PsFT1, which was induced by DEX. Using the Liquid nitrogen freeze-thaw method, pTA7001- PsFT1 was transfer into Agrobacterium tumefaciens, LBA4404, competent cell. In the mediation of Agrobacterium tumefaciens, we did genetic transformation of tobacco and poplarT89 Yang, in order to obtain transgenic plants which can effectively regulate FT gene expression, early flower and are normal fertility.

Key words：Populus simonii；PsFT1；plant expression vector；genetic transformation

目 录

1 文献综述………………………………………………………………………………1

1.1 FT概况………………………………………………………………1

1.1.1 FT基因的发现……………………………………………1

1.1.2 FT基因的结构和特点……………………………………2

1.1.3 FT基因的表达部位………………………………………2

1.1.4 FT基因的表达机制……………………………………………2

1.1.5 FT蛋白的长距离运输…………………………………………3

1.1.6 春化途径和自主途径中FT基因的作用………………4

1.1.7 光周期途径中FT基因的作用………………………4

1.2 化学诱导表达系统概况……………………………………………………4

1.2.1 化学诱导表达系统简介………………………………………4

1.2.2 构建化学诱导表达系统的策略………………………………5

1.2.3 双元调控可诱导系统…………………………………5

1.2.4理想的化学诱导表达系统………………………5

1.2.5 化学诱导系统的应用………………………………………5

2 材料与方法………………………………………………………………………7

2.1 材料准备……………………………………………………………………7

2.1.1 植物材料…………………………………………………7

2.1.2 菌株与载体………………………………………………8

2.1.3 仪器与设备………………………………………………8

2.1.4 使用试剂及有关溶液的配方………………………8

2.2 实验方法………………………………………………………………………9

2.2.1 提取质粒…………………………………………………9

2.2.2 LR反应…………………………………………………9

2.2.3CaCl2法快速制备大肠杆菌感受态……10

2.2.4 大肠杆菌转化……………………………………………10

2.2.5 菌液PCR检测阳性菌落……………………………11

2.2.6 农杆菌感受态制备…………………………………11

2.2.7 农杆菌转化…………………………………………12

2.2.8 植物遗传转化……………………………………12

2.2.8.1 材料准备…………………………………………12

2.2.8.2 农杆菌工程菌液的制备…………………………12

2.2.8.3 转化…………………………………………13

2.2.8.4 洗菌…………………………………………13

2.2.8.5 继续培养………………………………………13

3 实验结果……………………………………………………………………14

3.1 PsFT1基因DEX诱导性植物表达载体构建…………………14

3.1.1 载体…………………………………………………14

3.1.2 LR反应产物转化大肠杆菌………………………14

3.1.3 菌液PCR检测阳性克隆…………………………14

3.1.4农杆菌菌液PCR…………………………15

3.2 烟草和杨树遗传转化……………………………………………15

3.2.1 烟草遗传转化结果……………………………………15

3.2.2 杨树遗传转化结果……………………………………17

结论………………………………………………………………19

致谢……………………………………………………………20

参考文献………………………………………………………21

1 文献综述

1.1 FT概况

1.1.1 FT基因的发现

早在1865年，Sachs就对植物的开花机理展开了研究，他通过诱导开花实验提出了成花物质的概念，并分析出成花物质是从叶片传递到叶芽，从而导致开花，但是他的推断一直缺乏实验证据的支持（王团宗 等，2007）；Chailakhyan在1936年根据嫁接实验提出了成花素这一概念，他认为对光周期反应不同的植物间有相同的物质能够促进开花，因此人们认为成花素假说可以适用于不同植物，但是这些结果后来被证明不能重复；随后，人们发现从拟南芥开花中发现了两个重要的基因：CO和FT。CO和FT基因都不在茎顶端表达，CO基因在长日照时可以诱导叶片的FT基因表达；当两个基因特异的在茎尖表达时，FT基因就可以促进转基因植物的开花，然而CO基因却不可以。这证明了CO基因的主要作用是感受长日照，参与诱导FT基因表达，它本身不能诱导植物茎尖花芽分化；而FT基因虽然不在茎尖表达，但是FT基因的产物却可以在茎尖诱导植物开花(An et al.,2004)。据此，人们推测FT基因的产物可能就是成花素。2005年，Huang et al研究小组发现FT基因的mRNA可以从叶片转移到茎尖诱导植物开花，因此，他认为FT mRNA是成花素或是其中一部分(Huang et al.,2005)。2007年，英国、美国、德国和日本的科学家们通过分子生物学方法，以拟南芥为材料，用绿色荧光蛋白标记FT蛋白，用地塞米松诱导表达系统，从而得出了四个结论：（1）在一片叶中诱导产生的FT蛋白足够诱导植物花芽分化；（2）FT蛋白可从叶片转移到茎尖顶端；（3）FT蛋白在叶片中的表达并未诱导出其他与开花相关的成分；（4）在茎尖没有检测到FT mRNA的存在(Corbesier 等，2007)。众多数据显示，FT蛋白才是植物成花素，从而否定了FT mRNA是成花素的结论。

近年来，Kardailsky等人用激活标签的方法分离出一个早开花突变体，其表型是由于开花基因FT的过量表达而引起的；Liu等发现在拟南芥中CIB1蛋白和CRY2蛋白互作可激活FT基因的表达，从而促进开花；Corbesier等发现FT融合蛋白可以在韧皮部细胞特异性表达并移动到顶端，还可以在嫁接植物之间长距离移动；在许多单子叶和双子叶植物中已经分离出CO和FT的同源基因，过量表达CO和FT同源基因会使双子叶植物 (如: 杨树)和单子叶植物 (如: 水稻 )在适宜的光周期下早开花。