杨树miR164a植物过表达载体构建及遗传转化毕业论文

 2021-04-12 11:04

摘 要

NAC转录因子广泛参与植物生长发育、激素调控和环境胁迫应答,是一类调节植物体内各种生理反应的关键因子。近年来研究表明miR164a直接靶向杨树NAC1基因,可能在植物的抗病过程起到重要作用。

本研究将本实验室已克隆的杨树miR164a,通过LR反应构建植物过表达载体pH35GS-miR164a。反应产物转入大肠杆菌感受态细胞,采用菌液PCR鉴定出正确的重组子,并进行扩繁。然后通过液氮冻融法将构建好的植物表达载体转入农杆菌感受态细胞内,并同样采用菌液PCR进行阳性菌落。利用农杆菌转化法进行烟草的遗传转化,为进一步研究杨树miR164a在植物抗病反应中的作用提供理论依据。

关键词:杨树;miR164a;植物过表达载体;遗传转化

The Construction of miRNA164a from Poplar Plants Over-expressing Vector and Genetic Transformation

ABSTRACT

NAC transcription factors are widely involved in plant growth and development, hormonal regulation and environmental stress response, which is a kind of key factors regulating a variety of physiological reactions in plants. Recent studies show that miR164a directly targets poplar NAC1, that may play an important role in the process of disease resistance in plants.

In this study, we use poplar miR164a cloned in our laboratory to build a plant over-expression vector by LR reaction, which is then transformed into E.coli competent cells for propagation. And after identifying positive colonies through Bacteria Liquid PCR, we select the most suitable colonies to transform into Agrobacterium competent cells. We transfer miR164a into tobaccos with Agrobacterium-mediated transformation method. Our research provides a theoretical basis for further study of the role of poplar miR164a in plant disease resistance reactions and for further explanation.

Key words:poplar; miRNA164a;plant over-expression vector;tranformation

目 录

1 文献综述…………………………………………………………………………………………………1

1.1 miRNA………………………………………………………………………………………………1

1.1.1 miRNA的发现……………………………………………………………………………1

1.1.2 miRNA的形成……………………………………………………………………………1

1.1.3 miRNA的特点………………………………………………………………………………2

1.1.4 miRNA的作用方式…………………………………………………………………………2

1.1.5 miRNA的机制……………………………………………………………………………3

1.2 miRNA的作用……………………………………………………………………………………3

1.2.1 miRNA在植物生长发育中的作用………………………………………………………3

1.2.1.1 miRNA在植物开花及花器官发育中的作用……………………………………3

1.2.1.2 miRNA在植物叶片发育中的作用………………………………………………3

1.2.2 miRNA参与植物激素信号传导………………………………………………………4

1.2.3 miRNA参与自身代谢负反馈调节………………………………………………………4

1.2.4 miRNA参与抗生物胁迫…………………………………………………………………4

1.2.4.1 病毒…………………………………………………………………………4

1.2.4.2 真菌……………………………………………………………………………5

1.2.5 miRNA参与抗非生物胁迫………………………………………………………………5

1.2.5.1 抗营养元素胁迫………………………………………………………………5

1.2.5.2 抗环境胁迫……………………………………………………………………5

2 材料与方法………………………………………………………………………………………………7

2.1 材料准备…………………………………………………………………………………………7

2.1.1 植物材料…………………………………………………………………………………7

2.1.2 仪器与设备………………………………………………………………………………8

2.1.3 使用试剂及有关溶液的配方……………………………………………………………8

2.1.4 载体………………………………………………………………………………………8

2.2 方法与流程………………………………………………………………………………………9

2.2.1 挑菌培养…………………………………………………………………………………9

2.2.2 质粒的提取和浓度的测定………………………………………………………………9

2.2.2.1 质粒的提取………………………………………………………………………9

2.2.2.2 质粒浓度的测定………………………………………………………………10

2.2.3 LR反应……………………………………………………………………………………11

2.2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化……………………………………………………11

2.2.5 菌液PCR检测阳性菌落…………………………………………………………………12

2.2.6 农杆菌EHA105感受态细胞的制备和转化………………………………………………12

2.2.7 菌液PCR检测阳性菌落…………………………………………………………………13

2.2.8 农杆菌介导法转染植物…………………………………………………………………14

3 结果与分析………………………………………………………………………………………………15

3.1 质粒浓度的测定…………………………………………………………………………………15

3.2 大肠杆菌菌液PCR………………………………………………………………………………16

3.3 农杆菌EHA105菌液PCR………………………………………………………………………17

3.4 农杆菌转化法转植物……………………………………………………………………………18

结论 ………………………………………………………………………………………………………20

致谢 ………………………………………………………………………………………………………21

参考文献 …………………………………………………………………………………………………22

1 文献综述

1.1 miRNA

1.1.1 miRNA的发现

1993年,Lee等在秀丽新小杆线虫中发现了第一个能阶段性调控胚胎后期发育的基因lin-4[1]。时隔七年之后,Reinhart等又在线虫C.elegan中发现了第二个调控时序性发育的基因let-7。它们的长度很短(约22nt)且作用时间也是暂时的,所以最初叫做小时序RNA(stRNA);后来发现了大量类似的RNA,2001年便统称为miRNAs。迄今为止,已有250多个线虫、人、水稻、拟南芥等真核生物miRNAs被报道,在植物、线虫、果蝇和哺乳动物中已发现了一千多个miRNA 基因[2]

1.1.2 miRNA的形成

microRNAs(miRNAs)是一类长约22核苷酸的非编码的单链RNA分子,这些miRNA 基因首先在细胞核内转录成前体转录本(pri-miRNA),而后在核内被RnaseⅢ核酸酶Drosha加工成约70个核苷酸长的发夹状的RNA,在Exportin5 的帮助下从核内进入胞质内,然后在Dicer酶的作用下,单链的miRNA进入一个核糖蛋白复合体miRNP,David将其与RISC 等同[3]。miRNA 通过与靶基因的3′UTR 区互补配对,指导miRNP复合体对靶基因mRNA 进行切割或者翻译抑制。miRNA 到底是抑制还是切割取决于miRNA与靶序列互补配对的程度,互补配对高的可能进行切割,而配对低的就只是抑制。植物的miRNA与靶基因配对程度高多数是进行切割,而动物中miRNA与靶序列的配对性不好,多数进行翻译抑制。

动物中miRNA的成熟一般包括两个步骤:首先,miRNA编码基因在细胞核中进行转录,形成长度为几百nt左右的初级转录物,初级转录物进一步被加工成为只含单个miRNA的70nt左右的前体,并被运送出核;然后,在细胞质中miRNA前体形成茎环结构,在Dicer酶以及其它相关蛋白的作用下形成成熟的miRNA。现在认为,植物中Dicer酶对miRNA前体的加工过程极可能也发生在细胞核中,即miRNA基因在细胞核中边转录边加工,这样,在植物中就不存在miRNA前体从细胞核到细胞质的运输问题。

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