摘 要

科学家们从拟南芥属中分离了一种个新基因NACl，这一基因编码的蛋白质(NACl)被鉴别为是NAC家族的一个成员。NACl与NAC基因产物的其它成员在N-末端具有高度氨基酸序列同源性。研究显示NACl属于新鉴别的转录因子家族。NACl参与子叶和侧根发育的调节。比野生型,过表达该基因可导致植物产生更大的根和更多的侧根。

本研究将本实验室已克隆的杨树NAC1基因，通过LR反应构建植物过表达载体pH35GS-NAC1。将反应的产物转入大肠杆菌感受态细胞，然后采用菌液PCR鉴定出正确的重组子，将其扩繁。通过液氮冻融法将构建好的植物表达载体转入农杆菌感受态细胞内。然后利用农杆菌转化法进行烟草与杨树的遗传转化。

关键词：NAC1；表达载体构建；遗传转化；

Plant expression vector construction and genetic transformation of the poplar NAC1 gene

Scientists isolated a new gene NAC1from Arabidopsis, encoding protein (NACl) which was identified as a member of the NAC family. Other members of the NACl and NAC gene products with a high degree of homology of amino acid sequence at the N-terminus. Data shows that the transcription factor NACl belongs to a newly identified family. NACl is involved in the regulation of development of cotyledons and roots. Overexpression of NAC1 can lead to more roots and more lateral roots compared with wild type plants.

The poplar NAC1 cloned in our laboratory was constructed into a plant expression vector, pH35GS-NAC1, by LR reaction. The reaction product was transferred into competent cells of Escherichia coli, and the recombinant were identified by liquid PCR correctly and propagated. By freeze-thaw method, the plant expression vector was transferred into Agrobacterium competent cells. Then we transfer NAC1 into tobaccos and poplar with Agrobacterium-mediated transformation method.

Key words：NAC1, construction of expression vector, genetic transformation,

目录

1 文件综述 5

1.1NAC转录因子 5

1.1.1 NAC转录因子的发现 5

1.1.2 NAC转录因子的特点 5

1.1.3 NAC的起源 6

1.2NAC转录因子的作用 6

1.2.1植物次生生长 7

1.2.2细胞分裂和植株衰老 7

1.2.3 激素调控和信号转导 7

1.2.4 矿质元素营养和作物品质改良 8

1.2.5 生物胁迫中植物的防御反应 8

1.2.6 NAC转录因子在非生物逆境中的作用 9

1.2.7膜相关转录因子及其相关调控 9

2.材料与方法 10

2.1.1植物材料 10

2.1.1植物材料 10

2.1.2微生物材料 10

2.1.3仪器与设备 10

2.1.4使用试剂及有关溶液的配方 10

2.2提取质粒 10

2.3大肠杆菌感受态的制备 12

2.4转化大肠杆菌 13

2.5PCR技术 14

2.6连接载体 15

2.7转农杆菌 16

2.8转植物 17

3.结果与分析 18

3.1大肠杆菌质粒的提取 18

3.3 转植物 19

结 论 23

致 谢 24

1 文献综述

NAC基因家族编码一类转录因子,主要存在于植物中,其成员数量较多。NAC基因家族是植物所特有的一类重要转录因子,广泛参与植物生长、发育以及器官建成、逆境胁迫应答等反应。NAC类转录因子参与植物基因在不同条件、不同发育期的表达调控,在植物的发育、生长及对外界的各种生物和非生物因子的胁迫应答中起关键的调控作用。已有的研究表明, NAC 转录因子在植物多种发育以及信号转导过程中起作用。

1.1NAC转录因子

1.1.1 NAC转录因子的发现

1996年 Souer等从矮牵牛中克隆第一个 NAC转录因子 NAM, NAM 突变体可导致拟南芥幼胚缺失根尖分生组织、 幼苗缺失根和叶。1997年Aida等在拟南芥中发现了NAM、CUC2和ATAF1/2三种基因,CUC2 基因的功能类似于 NA M 基因, 与植物的发育相关; ATAF1 /2基因与植物逆境应答相关,NAM、CUC2、ATAF1/2基因编码蛋白的 N端都包含一段保守的氨基酸序列,约包含 150个氨基酸残基,取三基因首字母名为 NAC。

1.1.2 NAC转录因子的特点

植物转录因子的研究是功能基因组学研究的一个重要内容。近年来, 相继从高等植物中分离出一系列调控干旱、 高盐、 低温、 激素、 病原反应及发育相关的转录因子。植物在生长发育过程中经常受到如干旱、高盐、低温、病原菌等各种生物和非生物胁迫,通过一系列的信号传递,激发转录因子的产生;转录因子与相应的顺式作用元件结合, 激活下游逆境相关基因的表达。植物中存在着大量的转录因子,拟南芥中仅含有27000个基因,其中就有 5.9%的基因是编码转录因子,而在植物特异蛋白中,转录因子占到 13% [1]。根据 DNA结构域的不同, 植物中转录因子主要分为 MYB 、bZI P、 WRKY、DREB、NAC等。其中, NAC转录因子是近年来新发现的具有多种生物功能的植物特异转录因子。

NAC 转录因子是植物特有的一类转录因子, 在整个植物王国中广泛存在。该家族成员在其N端具有一个保守的大约由150 个氨基酸组成的NAC 结构域, C 端具有一个高度变异的转录激活区。已有的研究表明, NAC 转录因子在植物多种发育以及信号转导过程中起作用。

1.1.3 NAC的起源

基于广泛的序列比对发现, NAC基因只存在于植物中(Duval et al., 2002; Ooka et al., 2003)。借助了X-ray晶体衍射技术已经解析了拟南芥NAC蛋白ANAC019的N端三维结构, 它包含6条反向平行的β折叠和3个α螺旋, 其中部较长的4条β折叠与植物WRKY转录因子的4条β折叠在空间结构上具有较高的相似性。WRKY蛋白的1条β折叠包含WRKYGQK保守序列, 它在空间上弯曲形成了凹面, 表面带着正电荷, 负责与DNA结合。NAC蛋白也有一段类似的保守序列WKATGXD[K/R], 其弯曲产生的凹面分布着正电荷, 很可能也具有DNA结合功能。因此, NAC 和 WRKY 在进化上可能具有共同祖先(Yamasaki et al., 2005; Babu et al., 2006)。另外, 动物的GCM(glial cells missing)转录因子与WRKY蛋白也具有较高的同源性(Cohen et al., 2003)。目前却只发现部分 I 类 WRKY 蛋白存在于古真核生物中(Yamasaki et al., 2008)。 由此可推测三者的进化关系为: 动物的GCM和植物的NAC及WRKY转录因子共同起源于古真核生物的WRKY蛋白。

1.2NAC转录因子的作用

NAC转录因子广泛参与植物生长发育、 激素调控和环境胁迫应答, 是一类调节植物体内各种生理反应的关键因子,而且在植物光反应、 细胞程序性死亡和叶片凋亡中也起着重要调控作用,同时 NAC转录因子的表达具有组织特异性,受外界环境和不同发育时期的影响。

1.2.1植物次生生长

植物的次生生长是一项重要的生命活动，特别是次生木质部的形成对人类生产和生活具有重大意义. 次生生长包括维管组织形成、次生细胞壁形成、木质化、细胞程序化死亡以及心材形成等过程. 近年，研究发现多个NAC基因对细胞次生壁的形成起着正调控作用。

1.2.2细胞分裂和植株衰老

NAC基因能够通过调控细胞的分裂影响植物的生命周期. 膜蛋白水解和细胞分裂素信号能激活拟南芥NTM1（NAC with transmembrane motif 1）的表达，在其突变体中， 一系列CDK（cyclin-dependent kinases）抑制子基因被诱导表达，这些基因抑制组蛋白H4的合成，从而抑制了细胞分裂， 导致生长延迟。

1.2.3 激素调控和信号转导

赤霉素GA（Gibberellin acid）通过协调生长素和其他外源信号物质在种子萌发过程中发挥重要作用。膜结合的NAC转录因子NTL8（NTM 1-like 8）经不依赖ABA的GA途径介导了拟南芥种子萌发过程中的盐的调节. NTL8的表达受高盐和多效唑诱导， 但受到GA抑制. 高盐显著抑制GA3氧化酶-1基因的表达， 说明GA的生物合成抑制了种子的萌发. 相应地，拟南芥T-DNA插入突变体，ntl-8-1种子的萌发对高盐和多效唑具有抵抗力. 以上结果都表明在拟南芥种子萌发中，盐信号传导在GA途经中通过诱导NTL8的表达调控了种子萌发. Kunieda等发现NARS1和NARS2（NAC regulated seed morphology，NAC2和NAM）在调节珠被的发育方面存在功能重叠，进而影响到拟南芥种子的形态发生，nars1 nars2双突变体产生畸形种子， 而NARS1或NARS2的单突变体的种子的正常. 同时，nars1 nars2双突变体的珠被退化显著延迟，而野生型植株在鱼雷型胚胎时期便发生珠被的退化. 用nars1 nars2双突变体的花粉来给野生型雌蕊授粉，结出正常种子，反交则产生畸形种子。

1.2.4 矿质元素营养和作物品质改良

对NAC蛋白参与植物矿质元素营养的报道鲜见，有研究表明，NAC转录因子可能参与调节植物体铁元素的平衡. Ogo等从水稻和大麦中分离到一个铁缺乏响应条件IDE-2（Iron defi ciency responsive cisacting element 2）. IDEF-2属于NAC转录因子家族未定义的一个分支， 能与IDE-2特异结合. 研究发现，IDEF-2的功能受抑将导致水稻中的铁含量异常. IDEF-2 RNAi水稻中有很多基因的表达受到抑制，其启动子上都有IDEF-2的核心结合位点，并且侧翼序列与IDE2高度同源. 铁缺乏能导致Fe（Ⅱ）-烟酰胺运输基因OsYSL2等基因表达上调，而IDEF-2 RNAi植株受铁缺乏的影响较小，推测IDEF-2参与铁代谢相关基因的调节。

1.2.5 生物胁迫中植物的防御反应

NAC家族中的一些成员在植物病原胁迫应答中也发挥着重要的作用. 如拟南芥ATAF1广泛参与了生物和非生物胁迫响应，在感染灰霉病菌、假单胞菌后，或者用水杨酸、茉莉酸、1-氨基环丙烷-1-羧酸处理后，ATAF1的表达受到抑制. ATAF1过表达植株（ATAF1-OE）对丁香 假单胞杆菌番茄致病变种DC3000（Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000）敏感性增强，ATAF1嵌合抑制子（ATAF1-SRDX）诱导了防御的相关基因PR-1、PR-5和PDF1.2的表达，对DC3000的抵抗力增强，而这些基因在ATAF1-OE植株中受到抑制. NTL6（NTM1-like6）能诱导病原相关蛋白PR1/2/5的产生，NTL6的过量表达增强了拟南芥植株的抗病性，而NTL6 RNAi植株在低温下则表现出对病菌的敏感性.大麦HvNAC6是拟南芥ATAF1的同源基因，HvNAC6的过表达增强了耐渗透细胞对白粉病菌的抵抗力.表明HvNAC6和ATAF1分别在单子叶植物和双子叶植物中调节了渗透势. 拟南芥ATAF2是一个病原相关蛋白抑制子，对茉莉酸甲酯和水杨酸植物激素敏感， 但ABA对其没有影响，过量表达ATAF2的植株， 许多病原相关蛋白的合成受到抑制，并表现出对尖孢镰刀霉（Fusarium oxysporum）高度的敏感，而在2个ATAF2敲除系中有4个病原相关蛋白的含量都增加. 研究还表明了，ATAF类基因不仅在结构上相似，而且在胁迫响应上也具有保守性. 与拟南芥中的ATAF1和ATAF2类似，土豆StNAC也受到损伤的诱导. Lin等发现水稻OsNAC19参与了水稻对稻瘟病菌的响应， 同时茉莉酸甲酯和ABA能诱导其合成，表明OsNAC19可能在茉莉酸甲酯信号途径中发挥作用。

1.2.6 NAC转录因子在非生物逆境中的作用

干旱、高盐、低温等非生物环境因子，影响植物的生长发育， 甚至会造成植物死亡，严重影响农业生产和生态环境. 研究表明， 一系列来自不同家族的转录因子能够提高植物对胁迫的耐受力，如DREB 、MYB 、bZIP 和锌指蛋白. 近年来，诸多研究也表明NAC类转录因子参与了非生物胁迫应答并发挥着重要的作用.

1.2.7膜相关转录因子及其相关调控

膜 相 关 转 录 因 子（membrane associatedtranscription factors 简称 MTFs）的特点是转录因子翻译后被转运到质膜上，当细胞受到刺激便会从膜上被释放并转运到核中行使调控功能. 已知在酵母 原核生物和动物中存在 MTFs，转录激活目的基因表达行使多种功能

2.材料与方法

2.1材料准备

2.1.1植物材料

实验材料取自本实验室的T89优良无性系组培苗及烟草组培苗。组培苗以1/2MS培养基为基本培养基，培养室内温度为25士1℃，每天光照14h，光照强度2000Lx左右。

2.1.2 菌株和质粒

大肠杆菌，以LB培养基为基本培养基，摇床温度为37℃，250rpm

农杆菌,以LB培养基为基本培养基，摇床温度为28℃，100rpm