摘 要

杨树是我国主要的造林树种，近年来我国杨树造林面积不断扩大，已成为世界上杨树人工林面积最大的国家。由于造林大规模种植单一无性系杨树，一旦发生病虫害将会给整片林木带来毁灭性的灾难。美国白蛾（Hyphantria cunea）独特的生活习性，常规的化学与生物防治手段难以有效防治，对杨树的为害逐年加重，将对杨树及其产业造成巨大损失，利用转基因技术培育抗虫杨树新品种迫在眉睫。

本研究在筛选出对美国白蛾具高效特异毒杀作用的 Bt 基因的基础上，以南林895杨（Populus deltoides × P. euramericana cv. ‘Nanlin895’）为材料，开展转抗虫基因的遗传转化研究。主要研究进展如下：

（1）在保证基因氨基酸序列不变的情况下，利用杨树氨基酸偏好密码子，对 cry1Ah1 基因的杀虫关键区域进行优化和改造，使得 GC 含量提高，并去除内含子剪切信号等不稳定因素。在基因的上游添加了 Ω 序列和 Kozak 序列，下游添加了内质网定位信号（KDEL）和双终止识别序列。改造后的基因经人工合成，利用 Gateway 技术构建植物表达载体：PH35GS-cry1Ah1-1。

（2）将构建的植物表达载体转入农杆菌，在本实验室建立的南林 895 杨遗传转化体系的基础上，经筛选采用潮霉素 Hyg 20 mg/L 作为南林 895 杨不定芽再生时的选择压。本研究共获得转 cry1Ah1-1 基因的南林 895 杨 47 个株系。

（3）对获得的上述潮霉素抗性植株进行分子检测，利用 RT-PCR 试验，分析外源基因在转基因南林 895 杨中的表达情况。结果表明，两个插入的 cry1Ah1 基因比在非转基因杨树中表达增强。相对转录水平最高的修饰后的 cry1Ah1 基因是使用频繁最高的编码基因。

本研究结果为培育抗虫转基因杨树提供了实验依据。

关键词：美国白蛾；杨树；Cry 蛋白；cry1Ah1 基因

Abstract

Poplar is one of the important forest trees species with fast growth in the world. The area of poplar planting in China is the biggest around the world. Hyphantria cunea were hard to prevent through routine chemical and biocontrol methods owing to their special habits. Yields and quality of poplar were seriously affected. Therefore, it is extremely urgent to breed new species of insect resistance poplar.

In this study, we obtained genes which had insecticidal activity against Hyphantria cunea. Populus deltoides × P. euramericana cv. ‘Nanlin895’were used as experiment material. The main conclusion of this experiment was as following:

（1）In guarantee under the condition of invariable gene sequence of amino acids, amino acids of poplar preference codon, insecticidal key areas of cry1Ah1 genetic optimization and transformation, makes the GC content increased, the shear and remove introns signal instability, etc. Add Ω sequence and Kozak upstream of the gene sequence, add the endoplasmic reticulum downstream positioning signal (KDEL) and double terminated recognition sequence. After transformation of the gene by synthetic, using Gateway technology construction of plant expression vector: PH35GS cry1Ah1-1.

（2） Vectors were introduced into Populus deltoides × P. euramericana cv. ‘Nanlin895’via Agrobacterium tumefaciems . Through the sensitivity of poplar on the test, we found medium with Hyg 20 mg/Lwas more suitable for genetic transformation of poplar leaves. Three genes were transferred into Populus deltoides × P.euramericana cv. ‘Nanlin895’by PCR assay, and 23, 22 and 9 composite plants were positive, respectively.

（3）The results of real-time RT-PCR indicated that the expression level of two modified cry1Ah1 genes in poplar was extremely enhanced than the one without genetic modification. The highest relative transcription level of the modified cry1Ah1 genes was that using the highest frequent codons.

The results provide a experimental reference for cultivating insect-resistant transgenic poplar.

Key words: Hyphantria cunea; Populus deltoides × P. euramericana cv. ‘Nanlin895’; Cry proteins; cry1Ah1 gene; Condon optimization

目 录

1 前言 1

1.1 美国白蛾的危害 1

1.1.1 美国白蛾的生物学特性 1

1.1.1.1 食性杂 1

1.1.1.2 取食量大 1

1.1.1.3 繁殖力强 2

1.1.1.4 适应性强 2

1.1.1.5 传播途径广 2

1.1.2 美国白蛾的防治方法 2

1.1.2.1 人工防治 2

1.1.2.2 生物防治 2

1.1.2.3 化学防治 2

1.2 Bt基因工程研究进展 3

1.2.1 转 Bt 基因微生物研究进展 3

1.2.2 转Bt基因植物研究进展 4

1.2.3 转Bt基因杨树研究进展 4

1.2.4 转基因杨树生态安全性 4

1.3 苏云金芽胞杆菌 cry1Ah 基因的研究 5

1.3.1 Bt杀虫晶体蛋白基因的分类 5

1.3.2 Bt杀虫晶体蛋白作用机制 7

1.3.2.1 Bravo 模型 7

1.3.2.2 The Zhang模型 7

1.3.2.3 The Jurat – Fuentes 模型 7

1.4 本研究的目的和意义 7

1.4.1 研究目的 7

1.4.2 研究意义 8

2 将外源基因整合到细胞核外基因组中 9

2.1 植物转基因方法 9

2.1.1 直接基因转移 9

2.1.2 农杆菌介导基因转化 10

2.2 转基因杨树的分子检测 11

2.1.1 PCR 检测 11

2.2.2 RT-PCR 检测 11

3 Cry基因的遗传转化 13

3.1 材料与方法 13

3.1.1 植物材料 13

3.1.2 菌株和表达载体 13

3.1.3 仪器与设备 13

3.1.4 抗生素与激素 13

3.1.5 植物培养基 14

3.2 实验方法 14

3.2.1 南林895杨无菌苗的获得及处理方法 14

3.2.2 表达载体转化农杆菌 14

3.2.2.1 农杆菌感受态细胞的制备 14

3.2.2.2 电击法转化农杆菌 14

3.2.3 预培养 15

3.2.4 正负对照的设置 15

3.2.5 农杆菌的活化和侵染菌液的制备 16

3.2.5.1 菌株的活化 16

3.2.5.2 菌液的制备 16

3.2.6 农杆菌的侵染和共培养 16

3.2.7 转基因植株的获得 17

3.2.8 抗性植株的移栽 18

3.3 结果与分析 18

3.3.1 植物表达载体转化农杆菌 18

3.3.2 潮霉素筛选浓度的确定 18

4 转基因植株的分子检测 20

4.1 转基因杨树 DNA 提取 20

4.1.1 TIANGEN 试剂盒提取 20