摘 要

F-box蛋白是含有F-box结构域的一类特殊蛋白,广泛存在于真核生物。因其能够特异性识别底物蛋白从而在UPP途径中参与细胞周期调控，转录调控以及细胞信号传导等生命活动。在植物体中，F-box蛋白在植物激素的调节以及其他的信号传导过程中扮演着十分重要的角色。

利用生物信息学手段搜索毛果杨基因F-box基因家族成员，并以南林895杨(Populus deltoids × P. euramericana)为研究材料，采用RACE技术克隆获得F-box基因家族成员之一序列全长。利用生物信息学软件对该基因进行分析，将该基因命名为PeTIR13，包含了1755bp的可读框，编码585氨基酸，蛋白分子量为65607.5Kda，等电点为5.96。然后利用相关软件对序列进行了蛋白质的疏水性，信号肽，跨膜区域，以及蛋白质高级结构的预测等分析。最后采用PCR扩增了PeTIR13的ORF， 并通过LR反应构建了PeTIR1植物表达载体pMDC83- PeTIR1，为今后进行杨树基因转化，进一步研究其功能奠定一定的基础。

关键词：F-box蛋白; 南林895杨; PeTIR1

Poplar F-box gene cloning and construction of plant expression vector

ABSTRACT

F-box protein is a kind of protein family which contain F-box domain and is widespread in all kinds of plants. Because of the special recognition of substrate protein, the F-box protein family can participate in life process such as cell cycle regulation, transcriptional regulation and the cell signal transduction in the way of UPP. In plants, F-box protein family also plays an important role in the regulation of plant hormone and signal transduction.

Searching the gene family of Populus trichocarpa Torr genome in the way of bioinformatics’ means, we cloned a cDNA sequence of the F-box gene family with RACE method from poplar “Nanlin895”, the hybrid of P. deltoids × P. Euramericana. The new gene was named as PeTIR13 after analyzing the sequence with bioinformatics software. It contains an 1755bp ORF which codes a protein sequence of 585 amino acid. The molecular weight of the protein is 65607.5Kda, and its Isoelectric point is 5.96. Then we used the related software to analysis the protein in respects of hydrophobicity, signal peptide prediction, transmembrance domain prediction, senior protein structure prediction. At last, we cloned ti’s ORF and constructed it into a plant expression vector pMDC83- PeTIR1 by LR reaction. This study is prepared for gene transformation into poplar, or other plants for further study.

Keywords: F-box protein; poplar “Nanlin895”; PeTIR1

目 录

1 文献综述 - 1 -

1 F-box蛋白 - 1 -

1.1.1 F-box蛋白的发现及命名。 - 1 -

1.1.2 F-box蛋白的结构特点 - 1 -

1.1.3 F-box蛋白以及其复合体的作用机制 - 2 -

1.2 F-box蛋白的作用 - 3 -

1.2.1 F-box蛋白的普遍作用 - 3 -

1.2.2 F-box蛋白在植物体内的作用 - 4 -

1.3 F-box基因和蛋白的研究进展 - 5 -

1.4 植物基因克隆技术的发展及RACE技术 - 6 -

1.5杨树及其分布和用途 - 7 -

1.6本论文的研究目的 - 8 -

2 材料与方法 - 9 -

2.1材料 - 9 -

2.1.1 植物材料 - 9 -

2.1.2载体 - 9 -

2.2仪器与设备 - 10 -

2.3试验方法 - 10 -

2.3.1 总RNA提取与纯化 - 10 -

2.3.2设计引物 - 11 -

2.3.3 3′RACE - 11 -

2.3.4 5′RACE - 12 -

2.3.4.1 去磷酸化处理 - 12 -

2.3.4.2 “去帽子”的反应 - 13 -

2.3.4.3 5’RACE Adaptor的连接 - 13 -

2.3.4.4反转录反应 - 14 -

2.3.5全长基因的克隆及ORF扩增 - 15 -

2.3.6序列测定及分析 - 16 -

2.3.7 入门载体D-TOPO反应 - 16 -

2.3.8 LR反应 - 17 -

2.3.9菌液PCR检测阳性菌落 - 17 -

3 结果与分析 - 19 -

3.1 RACE扩增结果 - 19 -

3.2全长序列的拼接以及ORF可读框的获得 - 19 -

3.3 PeTIR1的生物信息学分析 - 20 -

3.3.1 杨树PeTIR1蛋白序列理化参数的分析 - 20 -

3.3.2 杨树PeTIR1蛋白信号肽的预测 - 20 -

3.3.3 杨树PeTIR1蛋白疏水性的分析 - 21 -

3.3.4杨树PeTIR1蛋白跨膜信号的分析 - 22 -

3.3.5杨树PeTIR1蛋白结构功能与分析 - 23 -

3.3.6杨树PeTIR1蛋白二级结构的预测 - 24 -

3.3.7杨树PeTIR1蛋白三级结构的预测 - 24 -

3.4 PeTIR1基因的同源对比和系统进化树的构建 - 25 -

3.4.1 序列选择 - 25 -

3.4.2 序列比对以及构建PeTIR1基因的进化树 - 26 -

3.5 植物表达载体的构建 - 27 -

结 论 - 28 -

致 谢 - 29 -

参考文献 - 30 -

1 文献综述

1 F-box蛋白

1.1.1 F-box蛋白的发现及命名。

F-box蛋白最初在1995年由kumar等发现的，他们在SCON2等多种蛋白中发现了一类相同的同源结构域^[1]。但此同源区域在当时并没有引起重视。直至1996年，Bai等的研究结果表明此结构域是蛋白质之间相互作用所必须的结构，而且很多种类的蛋白质中都含有此结构域^[2]。因为最初是在细胞周期蛋白F中发现了此同源区域。于是Bai等人将此结构域被命名为F-box结构域。而之后就将含有此类结构域的蛋白家族就被命名为F-box蛋白家族。

1.1.2 F-box蛋白的结构特点

F-box蛋白广泛存在于真核生物之中，目前已经从多种哺乳动物以及植物中发现了大量的F-box蛋白。从目前的研究看来看来，大多数的F-box蛋白的高级结构还不清楚，但是已知F-box结构域通常位于蛋白质的N端^[3]。而在F-box蛋白的C端则通常结合一些二级结构，这些二级结构与蛋白质的作用有很大的关系，并通过此结构来介导F-box蛋白与底物蛋白的特异性识别的功能。根据C端结构的不同，可以将F-box蛋白分类为3种，分别称它们为FBXL、FBXW、FBXO^[4]。其中，FBXL类的F-box蛋白C端含有富含亮氨酸重复序列的蛋白质。FBXW是C端含有WD重复序列。第三种FBXO中的O代表“其他”这种F-box蛋白的C端含有其他二级结构，例如亮氨酸拉链、锌指结构、环指结构、34肽重复序列（TPR）及脯氨酸富集区等。或是没有明显的结构特征此种F-box蛋白除了这些区域以外基本没有保守型。

F-box结构域是一段缺少严格的保守序列，由40至50个氨基酸残基组成，而此严格保守序列通常位于蛋白质的N端。在此段序列中仅有几个位置的氨基酸残基比较保守。分别为位置8（多为亮氨酸或甲硫氨酸）、位置9（脯氨酸）、位置16（异亮氨酸或缬氨酸）、位置20（亮氨酸或甲硫氨酸）、位置32（丝氨酸或半胱氨酸）^[5]。而除了这些位置之外，F-box结构域其他位置基本无保守性。这便导致我们很难凭借肉眼鉴别F-box结构域。

1.1.3 F-box蛋白以及其复合体的作用机制

在目前的研究中F-box最主要的作用是与其他亚结构形成SCF复合体。F-box结构域是SCF复合体的重要结构。SCF复合体最初在酵母菌中发现，是在泛素介导的蛋白质降解途径中的一类重要的E3泛素连接酶。其主要结构是由由Skp1蛋白,Cullin蛋白,Roc1、Rbx1、Hrt1其中的一种组分所组成的一种一般性的骨架以及任意一种F-box蛋白所构成的。这就使得SCF复合体具有能够特异性结合各种底物的特点。可以促进E2之间的作用，将泛素转移到E2上，并随后被降解^[6]。遗传分析表明，F-box蛋白在许多如激素信号传导等信号传导途径中发挥着重要的作用。