杂交鹅掌楸悬浮系细胞原生质体瞬间表达体系的建立毕业论文

 2021-04-12 11:04

摘 要

摘要:鹅掌楸是古老的木兰科植物中的一类重要代表,也是优质用材树种,对其基因功能的研究在进化和林木改良中都有着重要的意义。但受其生长周期长的特点的影响,极大的阻碍了其相关基因功能的研究。本文以杂交鹅掌楸胚性悬浮系细胞为材料,制备原生质体,建立起了杂交鹅掌楸悬浮系细胞原生质体的瞬间表达体系。技术体系包括选择继代3次以上的悬浮系细胞,用2%纤维素酶、0.1%果胶酶在0.4M甘露醇的条件下于23℃下黑暗酶解3h可以游离出3×106个/gFW原生质体,活性在85%以上。在PEG 25%,质粒10ug,转化时间25min,原生质体浓度1×106个/ml的条件下,可以获得较高的瞬间表达。

关键词:杂交鹅掌楸;悬浮系细胞; 原生质体; 转化; 瞬时表达

Establishment of Gene Transient Expression System in Liriodendron hybrids

ABSTRACT

Liriodendron is one of the important representatives in ancient magnoliaceae plants ,is also a high-quality timber species. Studying the function of gene of Liriodendron is essentital for both plant evolution and forest tree improvement.However,its length life cycle impedes rapid characterization of gene function.We optimized an efficient isolation of protoplasts from Liriodendron hybrids suspension cells and established Liriodendron hybrids suspension cells protoplast transient expression system. The major technical system includes: the enzymatic method is used to isolate suspension cells protoplasts. Maximum protoplast yield (3×106/gFW) and viability (85%) were achieved using a mixture of 2% (w/v) cellulase Onozuka R10 and 0.1% (w/v) Pectolyase in 0.4M mannitol solution for three hours with gentle shaking at 23℃and under dark conditions.Transient expression system can be gained by incubating the mixture contained 25% PEG, 10ug plasmid DNA and 1×106 protoplast cells.

Key words: Liriodendron hybrids;Suspension cells;Protoplast;Transformation;

Transient expression

目 录

摘 要 1

ABSTRACT 2

1 前言 1

1.1 概述 1

1.2 原生质体转化方法的研究进展 1

1.3 实验目的和意义 3

2 材料与方法 4

2.1 实验材料 4

2.2 实验仪器与设备 4

2.3 试剂 4

2.4 实验方法 5

2.4.1杂交鹅掌楸悬浮系细胞原生质体制备 5

2.4.2 利用PEG介导转化外源质粒DNA 5

3 结果与讨论 7

3.1原生质体的分离及影响因素 7

3.2原生质体的瞬时表达 8

3.2.1 原生质体瞬时表达结果 8

3.2.2 不同因素对瞬间表达的影响 8

结论 10

致谢 11

参考文献 12

1 前言

1.1 概述

植物原生质体是指脱去细胞壁的植物细胞[1]。植物原生质体的遗传转化是指以原生质体为受体,通过一定的途径或技术将外源基因导入植物原生质体内,获得能使外源基因稳定表达的转基因植株的技术。植物原生质体遗传转化分为稳定转染和瞬时表达,稳定转染指通过一定的转化手段将外源基因片段导入原生质体内并整合到植物基因组上进行表达,因此可以稳定地将导入的外源基因信息传递下去;而瞬时表达是将基因片段构建到瞬时表达载体上对植物原生质体或植物细胞进行转染,其结果是基因片段不整合到植物基因组上,只是利用载体上的表达单元进行表达,一个宿主细胞细胞中可存在多个拷贝数的瞬时表达载体,这样就可产生高水平的表达,但通常只持续几天,通常在1~2天内达到最高,随后又逐渐降低,至多10多天时完全消失,由于所导入的外源信息不会传递给子代细胞,多用于启动子和其他调控元件的分析。通过稳定转染产生的转基因植株已成为一项常规技术,是植物基因功能分析研究的一个有力工具,但转基因植株的不利之处在于成本较高,周期长,这也使得这项技术在植物基因功能分析中的广泛应用受到了限制。而瞬时表达技术可以很方便地用来研究植物基因的表达与功能[2; 3]。与稳定转染相比,瞬时表达有着诸多优点,例如在外源基因导入后短时间内就能很容易地检测到基因活性[4],这项技术已经被广泛的应用于启动子活性分析,基因亚细胞定位以及蛋白质定位等[5; 6]。近年来,随着基因组学和蛋白质组学的发展,科学家们开始利用瞬时表达技术进行基因功能高通量分析。植物原生质体的瞬时表达是用来分析植物基因活性的一种很好的方法,除了能达到较高的转化效率以外,原生质体的代谢过程、对植物激素的应答以及对环境激素的反应都与完整的植物细胞或组织细胞完全相同,为我们提供了一个分析植物信号转导途径的方便而有力的工具。

1.2 原生质体转化方法的研究进展

植物原生质体的遗传转化研究是从20世纪80年代以后逐渐开展起来的,现在已经有多种方法,其中最为常见的方法是PEG介导转化法、电击穿孔转化法、脂质体介导转化法和农杆菌共培养转化法等。

您需要先支付 80元 才能查看全部内容!立即支付

课题毕业论文、开题报告、任务书、外文翻译、程序设计、图纸设计等资料可联系客服协助查找,优先添加企业微信。