摘 要

百合不仅是一种优雅的观赏植物，而且可食用还具有药用价值，但其目前破坏程度日趋严重，濒危种类不断增多，野生百合的生存和繁衍受到较大程度的威胁。因此，研究百合属植物遗传多样性及亲缘关系对于指导百合亲本选配，继而有针对性地培育百合新品种至关重要。

本研究中用CTAB法提取22种野生百合及8种商品种的高质量基因组DNA。共筛选272对SRAP引物组合，最终选取21对条带清晰、多态性较好的引物组合，对30个百合样本进行SRAP标记，共得到867个位点。同时还对现有的SRAP标记体系进行优化得到最理想的体系组合。本实验使用Cross Checker2.91对PAGE银染胶图中的位点信息进行自动判读得出二元数据。使用Phylip3.69软件包中的三种建树方法对所得数据进行系统发生重建，再用MEGA5软件绘制百合属部分种及品种的系统发生图，揭示其遗传多样性，明晰百合原生种与园艺栽培品种间的亲缘关系。

关键词：百合；SRAP；CTAB；PAGE；系统发生树；亲缘关系

Abstract

Lilium is not only an elegant ornamental plant, also edible and medicinally valuable. but with growing environmental damage, the survival and reproduction of wild Lilium species became difficult. So, for guiding the lily parent selection and then developing new lily varieties on purpose, the study of the genetic diversity and genetic relationship of Lilium is important.

This experiment extracted high quality genomic DNA of 22 Lilium species and 8 representative lily cultivars with CTAB method. 21 polymorphic SRAP primers including 867 polymorphic loci were chosen to analyze the genetic diversity of 30 Lilium samples. At the same time , the SRAP PCR reaction system was optimized and the most ideal system was acquired. The bandseek and binary interpretation of PAGE silver stain figure were automatically conducted in Cross Checker 2.91 software. This research then respectively used three tree-building methods to conduct phylogenetic reconstruction on these data via Phylip3.69 software, and plotted as phylogram by MEGA5 software, to reveal the genetic diversity and clarify the genetic relationship between Lilium native species and Gardening cultivated varieties.

Keywords: Lilium; SRAP; CTAB; PAGE; phylogenetic tree; genetic relationship

目录

前言 1

1.文献综述 2

1.1百合属资源概况 2

1.1.1百合属的起源与分布 2

1.1.2百合属的形态特征 2

1.1.3百合属的栽培与应用 3

1.1.4百合属资源的保护与利用 4

1.2分子系统学概述 4

1.2.1分子系统学简史 4

1.2.2分子系统学特点 5

1.3方法论 5

1.4技术手段 6

1.4.1核酸序列分析 6

1.4.2 DNA分子标记 6

1.5系统发生重建关键问题 7

1.5.1基因/分子标记的选择 7

1.5.2建树方法的选择 8

1.5.3核苷酸替换模型的选择 10

1.5.4系统发生树的检验评估 11

1.6百合属系统发生研究进展 12

1.6.1百合属原生种的形态分类 12

1.6.2园艺栽培品种的划分 13

1.6.3百合属分子系统学研究进展 14

1.6.4百合属系统发生热点问题 15

1.7研究的目的意义 16

2.材料与方法 17

2.1实验材料 17

2.2实验试剂 19

2.2.1 DNA提取试剂 19

2.2.2 PCR扩增相关试剂 19

2.2.3电泳相关试剂 19

2.2.4 PAGE银染相关试剂 20

2.3实验仪器设备 20

2.4基因组DNA的提取及质量检测 20

2.4.1 CTAB法提取植物基因组DNA 20

2.4.2紫外分光光度计检测DNA质量 21

2.4.3琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量 21

2.5 SRAP引物筛选 21

2.6 SRAP标记体系的建立与优化 24

2.7 PCR扩增产物的PAGE检测 25

2.7.1非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 25

2.7.2聚丙烯酰胺凝胶银染 25

2.7.3 PAGE图像处理与数据获得 26

2.8数据的统计与分析 27

2.8.1引物扩增条带统计 27

2.8.2二元数据格式标准化 27

2.8.3最小进化法（ME）构建系统发生树 27

2.8.4邻接法（NJ）构建系统发生树 29

2.8.5最大简约法（MP）构建系统发生树 30

2.8.6树的绘制和注释 31

3.结果与分析 32

3.1 DNA模板质量检测 32

3.2 SRAP标记体系的优化 32

3.3 SRAP引物组合多态性 34

3.4系统发生分析 35

3.4.1 SRAP最小进化树（ME tree）分析 35

3.4.2 SRAP邻接树（NJ tree）分析 37

3.4.3 SRAP最大简约树（MP tree）分析 38

4.讨论 39

4.1引物序列对SRAP扩增效果的影响 39

4.2 PCR buffer浓度对SRAP扩增效果的影响 39

4.3对SRAP分子树效果不理想的解释 40

致谢 41

参考文献 42

前言

百合（Lilium）是百合属植物的总称，花姿优雅，色泽鲜艳，茎秆挺立，是五大鲜切花之一。可被用作鲜切花、盆花或直接在园林中栽培观赏，还具有食用与药用价值。百合在荷兰鲜切花的排名已上升第5位，有球根花卉之王的称号。

SRAP（sequence-related amplified polymorphism）即相关序列扩增多态性，是基于PCR的一种分子标记技术。其原理是利用独特的引物设计对ORFs（open reading frames，开放阅读框架）进行扩增，上游引物对外显子进行特异扩增。下游引物对内含子和启动子区域进行特异扩增，因个体不同以及物种的内含子、启动子与间隔长度不等而产生多态性。

SRAP标记不仅操作简便易行，而且产率高便于目标片段的克隆，使用长17－18bp的引物以及50℃的退火温度，保证了扩增结果的稳定性。另外，SRAP引物3’'端3个选择性碱基可以随意改变，同时上游与下游引物也可以随意组配扩增，因此用少数的引物就可以进行多种组合的扩增，大大提高了引物的使用效率和对物种多态性扩增的丰富度，同时也减少了合成引物的成本。