小佛肚竹遗传转化体系的初步建立毕业论文

 2021-04-12 11:04

摘 要

小佛肚竹因其奇特的形态特征和其优良的自然属性而成为著名的观赏竹种。本试验以生长状态良好的小佛肚竹胚性愈伤组织为材料,初步建立了小佛肚竹遗传转化体系。

本实验的主要结果如下:

1、对小佛肚竹愈伤组织进行抗生素敏感性测试,以浓度为50mg/L的潮霉素和40mg/L的PPT为最好。

2、设定不同浓度的含有GUS基因的农杆菌菌液对愈伤组织进行侵染。经PCR扩增并经电泳检测后发现,pCAMBIA 1301质粒没有成功完整地转化进入农杆菌感受态细胞。

关键字:小佛肚竹 愈伤组织 抗性筛选 遗传转化

Abstract

Bambusa ventricosa has become an important bamboo species for ornament because of its fancy shape character and natural excellent properties. With the materials of the Bambusa ventricosa callus which has the ability to embryogenesis, this study attempt to establish the genetic transformation system of Bambusa ventricosa.

The results of this experiment are as follows:

1. It is indicated that there is good screening effect when the concentration of Hyg is 50mg/L or the concentration of PPT is 40mg/L through the antibiotics sensitivity test for the callus.

2. Infect to the callus with the different concentration of the Agrobacterium bacterium liquid which including GUS gene. It is a pity that the establishment of genetic transformation system of Bambusa ventricosa is failed. The pCAMBIA 1301 plasmid failed to transform into the cells through the PCR electrophoresis detection.

Keywords: Bambusa ventricosa;callus;resistance screening;genetic transformation

目录

1文献综述 1

1.1 国内外研究进展 1

1.2 课题研究的目的及意义 2

1.2.1 课题研究的目的 2

1.2.2 课题研究的意义 3

2 愈伤组织对不同抗生素的敏感性测试 4

2.1引言 4

2.2 材料与方法 4

2.2.1 试验材料与试剂 4

2.2.2 培养基与培养条件 4

2.2.3 试验方法 4

2.3 结果与分析 5

2.3.1 PPT对小佛肚竹胚性愈伤生长的影响 5

2.3.2 潮霉素对小佛肚竹胚性愈伤生长的影响 5

3 农杆菌介导的遗传转化 9

3.1 引言 9

3.2 材料与方法 9

3.2.1 实验材料 9

3.2.2 培养基 10

3.2.3 实验方法 10

3.3 结果与分析 13

4 结论与讨论 14

致 谢 15

参考文献: 16

附 录 17

1文献综述

植物遗传转化的研究起始于二十世纪七十年代末期,因为植物遗传转化是基于基因水平上改造植物的遗传物质,具有科学性和精确性,所以其技术的建立和发展,使特定的基因能够根据人们的意愿,在不同种属之间进行转化,扩展了常规育种的范围,提高了育种的目的性和可操作性,实现了基因在生物界的公用性,丰富了基因资源。为植物性状改良提供了一条新的重要途径。转基因技术的发展为竹子育种提供了一条新的途径。

竹类植物是禾本科(Ggramineae)竹亚科(Bambusoideae)植物的总称,全世界约有70多属1200多种[12]。竹类植物是地球陆地生态系统的重要组成部分,生长快、产量高 、用途广,主要应用于农业、手工业、建筑业、人造板、造纸、竹笋生产等。不仅具有重要的经济价值,而且具有良好的水源涵养和水土保持功能。有人认为“没有竹子, 陆地将没有生命”。此外,竹子具有似草非草、似树非树的特性,因此竹类植物研究愈来愈受到重视。我国是世界上竹类资源最为丰富、竹林面积最大的国家,共有34属600多个竹种(变种、变型)竹林面积500万hm2,占全国森林总面积的4%以上,产量1.3亿吨;2006年竹业年产值可达598亿元,不论是竹林面积、竹种数量、竹笋和竹材产量均居世界首位,被誉为“竹子王国”[13]

1.1 国内外研究进展

植物遗传转化包括在农业和林业方面的应用。比如农杆菌介导BADH基因转化葡萄的研究中,以葡萄品种鲁贝的花丝为试材,在葡萄的细胞悬浮系得到胚性愈伤组织及悬浮细胞再生植株的基础上,通过农杆菌介导转化甜菜碱醛脱氢酶基因,利用共培养后GUS染色组织分析探讨了影响转化效率的各种因素,优化了转化体系[7]。组培苗经PCR检测,证明获得了转基因葡萄植株。另外,水稻转基因方法评价及在种质创新上的应用的研究也取得了相应的进展,并且展望了转几丁质酶基因防治水稻纹枯病研究的发展前景[6]

转基因研究在林业方面也进行得如火如荼。包括对木本植物和草本植物的研究。木本植物由于本身的特殊性使其遗传转化较为困难,但根据植物类型及其生长特点,选取不同的受体系统,采用农杆菌介导进行转化,已在多种木本植物上获得成功。自从Parson等证实杨树可以进行遗传转化和外源基因在林木细胞中表达以来,林木基因工程研究已经取得很大进展。现已对杨树、火炬松、桉树等20多个树种进行了转化研究。许多树种已获得了转基因植株,其中杨树、松树、桉树、云杉等树种已经进入田间试验阶段,在抗虫、抗病、抗除草剂、耐盐、耐旱、耐冻、耐高温等方面也进行了转化研究。应用基因工程进行林木育种不仅可以缩短育种周期, 又可在基因水平上改造林木抗性遗传物质, 提高了育种的目的性和可操作性[8]

转基因技术也为竹类的研究开辟了一条全新的路径。1995年石竹的基因操作在日本首获成功。该研究所用这项技术导入石竹斑纹病毒的壳蛋白基因,培育出了抗病毒性石竹。竹类基因转导的研究迅速开展了起来。首先是各类竹种愈伤组织的诱导和增殖,建立悬浮细胞系,为竹子基因转化提供受体材料。现阶段有金丝慈竹、孝顺竹等竹类愈伤组织诱导及植株再生的研究,并且得到了不同外植体诱导愈伤的最佳配方,以及对影响愈伤组织培养的因素进行了分析。另外,卓仁英等(2004)用冰冻法将pBIGUSE 质粒转化农杆菌EHA105,然后用此农杆菌对麻竹愈伤组织浸染[1]。转化后的受体材料在含有潮霉素(Hyg) 的培养基中培养数日, 随机取3株转基因再生植株和2块抗性愈伤组织,进行GUS基因检测,经过乙醇脱色,观察到蓝点,说明在转化的愈伤组织中有GUS基因表达,提取基因组DNA再进行PCR检测,结果所选样本都呈阳性,而所选对照不仅没有观察到蓝点,而且PCR检测时也没有扩增出产物。这些结果说明含有GUS的基因已经整合到麻竹基因组中,初步建立了麻竹转基因技术体系,为丛生竹类转基因育种奠定了基础。俄罗斯形态遗传学研究所的专家利用转基因技术,培育出横截面为方形的竹子[11]。用这种竹子砌筑的墙壁能像空心砖墙壁一样,提高房屋的保温隔热性能。科研人员从蜡菊的细胞中分离出塑造蜡菊秆形的基因,将其转入拟南芥细胞中。经过实验改进,研究者培育出方秆拟南芥。此后,将方秆拟南芥的秆形塑造基因和伞形科植物--大型白芷的光合作用基因导入竹子细胞中,并最终在伏尔加河下游地区培植出方秆竹子。

进入本世纪以来, 随着现代分子生物学及DNA标记技术的发展,人们也开始从DNA水平来研究物种的系统分类问题。李淑娴等将水稻微卫星引物应用到竹子分子系统的研究上[14];诸葛强等利用PCR扩增产物直接测序的方法分析了广义青篱竹属(Arundinaria)中有关争议类群的代表种或模式种(毛竹为外类群)等18种竹种的核糖体DNA内转录间隔区(Internal Transcribed Spacers,ITS)序列[15]

1.2 课题研究的目的及意义

1.2.1 课题研究的目的

小佛肚竹为著名的观赏竹种,属簕竹属(Bambusa)刺竹亚属(Subgen.Bambusa),具2种秆形:1,正常秆形小佛肚竹生于野外粗放经营,高可达8~10m,径5~7cm,节间长20~35cm,下部略呈之字形曲折,秆下部具软刺,中部多枝簇生,其中3枝较粗长;2,畸形秆形小佛肚竹高25~60cm,径0.5~2cm,节间短缩肿胀呈花瓶状,长2~5cm。后者常用于制作盆景及庭院栽培作观赏用,为著名的观赏竹种。两种秆初时均被薄白粉,光滑无毛,秆环和箨环下有一圈易脱落的棕灰色毯毛状毛环。小佛肚竹地下茎为合轴型,从秆基芽眼萌发成笋长出竹秆。出笋期为8~ 11月份,野外栽培无大小年之分,萌发出笋能力强,盆栽出笋少甚至不出笋,8月初始见出笋,9月中旬~10月上旬为出笋盛期,11月上旬笋终见。本种不耐严寒,0度以下低温易受冻害。

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