摘 要

随着杨树种植面积的逐年增加,由于树种单一、生物多样性低,使得杨树虫害发生率很高,特别是杨舟蛾类、杨黄卷叶螟等害虫。Bt基因对杨树鳞翅目害虫有着毒杀效果。本次实验通过PMI标记基因农杆菌介导的方法，将Bt基因转入杨树基因组，为培育抗虫转基因杨树新品种提供基础。主要实验结果如下：

采用895杨的叶片和芽为试验材料，通过PMI选择标记基因，利用农杆菌侵染法，进行转基因实验。经过筛选获得到较为合适的甘露糖选择浓度，叶片分化筛选培养中甘露糖8g/l和蔗糖22g/l；芽生长筛选培养基中甘露糖10g/l和蔗糖20g/l。通过选择不同侵染菌液浓度和侵染时间，获得了较合适的遗传转化条件：侵染菌液的OD为1.0，侵染时间为15min。并获得了一批转Bt基因杨树植株，经PCR分子检测，有些转基因植株中可观察到外源Bt基因的导入。

关键词：南林895杨；Bt抗虫基因；转基因；筛选标记

Analysis of transgenic poplars with PEPC and Bt genes

Abstract

As the poplar planting area increased year by year, due to a single species, biodiversity is low, making the high incidence of poplar pests, especially moths Yang Zhou, Yang yellow leaf roller and other pests.Bt gene has a toxic effect of lepidopterous pests of poplar by Agrobacterium PMI marker gene approach can be Bt gene into poplar genome, As the undergraduate thesis of this experiment, the main study are as follows.

use the leaves and buds of 895polar tree as our experimental materials,through the method PMI to select the mark gene,and use the Agrobacterium infection method to proceed transgenic experiments.After screened to select the more appropriate concentration of mannose:Differentiation of cultured leaf filter:Mannose8g/l and Sucrose22g/l;Bud growth selection medium:Mannose10g/l and Sucrose 20g/l.By selecting a different infection bacterial concentration and infection time to obtain a more suitable conditions for genetic transformation:concentration of agrobacterium:OD=1.0;infection time:15min.And acquired a batch Bt gene poplar plant,through the PCR molecule detection, in some transgenic plants Exogenous Bt gene import can be observed.

Key words: Nanlin 895;Bt gene;transformation;selectable market

目录

第一章 文献综述 1

1 苏云金芽孢杆菌杀虫结晶蛋白（Bt）基因 1

1.1 Bt基因分类 1

1.2 Bt基因国内外研究 1

2 选择标记基因 2

2.1 PMI基因筛选体系 3

2.1.1PMI基因作用机理 3

2.1.2PMI转化系统的影响因素 3

3 转基因杨树的分子检测 4

3.1 PCR 4

4研究目的和意义 5

第二章 南林895杨遗传转化 6

1材料 6

1.1植物材料 6

1.2菌株和质粒 6

1.3抗生素与激素 6

1.4植物培养基 6

1.4.1 植物培养基 6

2 实验方法 7

2.1农杆菌介导的遗传转化（叶盘法） 7

2.1.1 灭菌 7

2.1.2预培养 7

2.1.3 正负对照 7

2.1.4农杆菌的侵染和共培养 8

2.1.5分步筛选培养获得抗性植株 8

3结果与分析 9

3.1菌液的浓度对芽生长的影响 9

3.2侵染时间对芽生长的影响 10

3.3 甘露糖浓度对遗传转化的影响 10

3.3.1 甘露糖对叶片芽分化的影响 10

3.3.2 甘露糖对芽伸长的影响 11

4 讨论 11

1 材料 13

1.1植物材料 13

1.2 试剂 13

2 实验方法 13

2.1 转基因杨树DNA提取（TIANGEN试剂盒） 13

2.2 转基因杨树PCR检测 14

2.2.1 引物设计 14

2.2.2 PCR反应体系 14

2.2.3 PCR反应程序 14

2.2.4 电泳检测 15

3 结果分析 15

4结论 16

致谢 17

参考文献 18

第一章 文献综述

随着杨树种植面积的逐年增加,由于树种单一、生物多样性低,使得杨树虫害发生率很高,特别是杨舟蛾类、杨黄卷叶螟等害虫。根据杨树食叶害虫发生的特点,采取了多种切实可行的防治措施,收到了良好的效果,保障了杨树的健康生长,促进了杨树产业的持续、稳定发展。

1 苏云金芽孢杆菌杀虫结晶蛋白（Bt）基因

苏云金杆菌（Bacillus thurigiensis, Bt）制剂，其会产生大量的伴胞晶体蛋白对昆虫幼虫有很大的毒杀效果，一直以来用于害虫的预防作用。伴胞晶体由具有高度特异性杀虫活性的结晶蛋白组成（崔金杰，1999）。

1.1 Bt基因分类

根据毒蛋白基因的序列同源性和它们编码蛋白的抗虫谱，可将Bt基因划分为4类（袁胜亮，2007；于德花，2007）。类型I（CryI）的蛋白具有抗鳞翅目昆虫的活性；类型II（CryII）具有抗鳞翅目和双翅目的活性；类型III（CryIII）为鞘翅目特异性；类型IV（CryIV）对双翅目有毒杀效果。最近几年中，还发现类型V（CryV）既对鳞翅目又对双翅目有特异性（谢先芝，1999）。

1.2 Bt基因国内外研究

Bt基因最早被利用报道是1987年Mentagn实验室Veack等首次报道获得抗虫转Bt基因烟草，从那之后人们对Bt杀虫蛋白基因的修饰和改造，表达载体的构建，植物遗传转化方法及抗虫转基因植物的培育等方面进行了大量的研究（王关林，1998）。Bt基因主要作用于杨树鳞翅目害虫。

1990年中国农业科学院范云六等成功地将对鳞翅目昆虫有毒性的Bt毒蛋白基因用根瘤农杆菌导入欧洲黑杨获得转基因植株。分子杂交证实了Bt晶体蛋白基因已整合到杨树的基因组中。