摘 要

本研究利用ISSR和SRAP分子标记，对在新疆收集的石竹属植物资源进行了种间指纹图谱分子构建。结果如下：

通过正交设计对两种分子标记进行体系的优化实验，得到稳定可靠的反应体系。SRAP优化体系为Mg² 2.5mmol/L、dNTP 0.25mmol/L、引物0.25µmol/L、Taq酶为1.0U。ISSR优化体系为Mg² 1.25mmol/L、dNTP 0.425mmol/L、引物0.8µmol/L、Taq酶为0.5U。

利用SRAP和ISSR分子标记对石竹属10个种的DNA（各8-9个个体建立的DNA池）分析，成功构建了石竹属植物的指纹图谱。其中，SRAP分子标记需要4对引物的组合可以将10个种鉴别出来， 而ISSR分子标记则需要5对引物的组合，这进一步验证了SRAP标记用于构建植物种间指纹图谱的可行性和优越性。

关键字：石竹，正交设计，指纹图谱

Abstract

In this study, ISSR and SRAP molecular markers was used to construct interspecific fingerprint of the genus Dianthus which collected in Xinjiang. The results are as follows:

The system of the molecular markers was both executed the optimization experiments by orthogonal, and we could have a steady and reliable response system. The SRAP optimization system was Mg² 2.5 mmol / L, dNTP 0.25mmol / L, primer 0.25μmol / L, Taq enzyme 1.0U. The ISSR optimization system was Mg² 1.25 mmol / L, dNTP 0.425mmol / L, primer 0.8μmol / L, Taq enzyme 0.5U.

The fingerprint of the genus Dianthus was constructed successfully by using SRAP and ISSR molecular markers to analysis the 10 species of Dianthus DNA (each DNA pool established by 8-9 individuals). Which, SRAP markers need 4 combinations of primers to identify 10 species, and ISSR molecular markers requires a combination of 5 pairs of primers. This was further validated that the SRAP marker has feasibility and superiority in building fingerprint of plant species.

Key Words：Dianthus, Orthogonal design, Fingerprint

1 文献综述

1.1 DNA指纹图谱

遗传标记在遗传学的建立和发展过程中有着举足轻重的作用，同时它也是作物遗传育种的重要的工具。随着遗传学的进一步发展和分子生物学的异军突起，遗传标记先后相应地经历了形态标记、细胞学标记、生化标记和DNA分子标记四个发展阶段。前三种标记都是基因表达的结果为基础的，是对基因的间接反映；而DNA分子标记则是DNA水平遗传变异的直接反映，它具有能对各个发育时期的个体、各个组织、器官甚至细胞作出“中性”以及操作简便等特点。正是这些特点，奠定了它极其广泛的应用基础。DNA分子标记本质上是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异特DNA片段。DNA分子标记大多以电泳谱带的形式表现生物个体之间DNA差异，通常也称为DNA的指纹图谱。目前指纹图谱构建已广泛应用，构建指纹图谱的方法有多种,都分别从不同的角度反映了作物的遗传信息^[1~6]如：利用ISSR标记构建红花檵木品种指纹图谱^[7]。还有利用SSR，AFLP标记技术对甘肃地方核桃种质资源遗传多样性分析^[8]。除此以外已构建了水稻、番茄、棉花等30多种植物的遗传图谱。

由于DNA指纹图谱的高度特异性和稳定性，世界各国目前已经在罪犯的确认、血清鉴定、确定遇难者身份方面广泛使用这种技术。例如，在“9.11”恐怖袭击事件中，几千名遇难者的尸体支离破碎，科学家便利用DNA指纹技术鉴别死者身份。除此，可以利用DNA指纹技术可以检测不同物种。同种及同种不同个体的亲缘关系，也可以进行物种分类鉴定、起源进化的研究。目前，DNA指纹技术凭借自身技术简单、准确、快速等优点。在植物品种鉴定方面展示了广阔的应用前景。

1.2石竹属生物学背景

石竹属(Dianthus L.)为石竹科(Caryophyllaceae)一、二年生或多年生草本。全球约有600余种，广布于北温带，主要分布于欧亚大陆，尤其是地中海地区，少数产北美和北非。我国石竹属依据花簇生、单生或成疏聚伞花序、花梗长短、花瓣齿裂或繸裂等形态特征分为4组，即簇花组sect.Carthusianum Williams， 齿瓣组sect.Barbulatum Williams，石竹组sect.Dianthus和繸裂组 sect.Fimbriatum Williams。石竹属(Dianthus L.)植物为重要的花卉品种资源，有不少栽培种类,是很好的观赏花卉,其中香石竹(Dianthus caryophyllus)，又名康乃馨(Carnation)，为世界四大鲜切花之一^[9]，是风靡全球的著名花卉。

1.3国内外研究进展

在石竹属中，由于香石竹是是目前世界上应用最普遍的花卉之一，所以国内外对其都进行了深入的研究。香石竹别名康乃馨，我国上海于1910年开始引种生产，目前品种在100种以上,但无自己培育的品种。栽培的主要品种有独头品种（红花品种，玫瑰红品种，粉色品种，白花品种，黄色品种，杂色品种）、小花品种和多头品种^[9]。在转基因研究方面，蔡友铭等利用RAPD标记分析了中国石竹属10个种和10个栽培品种，并讨论了种间及品种间的亲缘关系^[10]。余义勋^[11]等通过将香石竹ACC氧化酶基因构建为表达载体，再导入根癌农杆菌LBA4404菌株,并转化香石竹品种Master、爱卡迪幼叶,经PCR检测和Southern杂交鉴定,获得了8株转化植珠。还有何秋伶等在建立香石竹叶片离体培养再生体系的基础上,将双价抗病基因构建在同一个植物表达载体上，增强香石竹抗病性 ^[12]。

1.4分子标记种类及发展历程

广义的分子标记(molecular marker)是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。狭义的分子标记概念就是指DNA标记,而这个界定现在被广泛采纳。在过去10多年中，分子标记技术得到了突飞猛进的发展，至今已有几十种分子标记技术相继出现，并在作物遗传育种、基因组作图、基因定位、植物亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等各个研究领域得到了广泛的应用。DNA标一记主要包括三大类，分别为^[13]:一、基于DNA分子杂交的DNA标记。如:RFLP二、基于PCR技术的DNA扩增方法。如:RAPD、三、基于DNA序列和芯片的分子标记。如:SNP它们也可以分别被称为第一代，第二代和第三代分子标记。其中第二类基于PCR技术的DNA扩增方法，又分为3类:1.使用随机引物和利用特定引物或成对引物扩增的标记。如:RAPD、ISSR。2.使用PCR与酶切相结合的方法。如:AFLP。3.利用反转录转座子的分子标记。如:IRAP、REMAP

分子标记自80年代初有人提出用RFLP作为遗传标记构建遗传连锁图谱的设想，以及自80年代中期PCR技术诞生以来迄今为止已发展了许多种基于DNA多态性的分子标记技术，有的已广泛地应用于遗传学研究的各个领域^[14]

主要的分子标记技术包括RFLP(限制性片段长度多态性)、RAPD(随机扩增多态性DNA)、AFLP（扩增片段长度多态性）、SSR（简单序列重复）、ISSR（重复序列间扩增）、SRAP（相关序列扩增多态性）等。RFLP标记法是目前使用较为广泛的一种标记技术。与传统的遗传标记相比，RFLP标记具有许多优点，诸如，标记源于基因组DNA自身的变异，如突变、易位和倒位等，其标记数量较大；无表现型效应，检测不受环境条件和发育阶段的影响；呈简单的共显性遗传，也不受杂交组合方式的影响等。该技术特别适合构建遗传连锁图谱。RARD标记法以人工合成的随机核苷酸序列为引物，以基因组总DNA为模板的标记技术。其特点是 ①所需引物短,且可随机设计；②没有种属特异性，合成一套引物可以用于不同基因组的分析；③所需DNA用量少，操作程序简便快速，无需制备克隆、同位素标记及分子杂交等。缺点是每个标记提供的信息量少，重复性差等。AFLP标记法是通过DNA多聚酶链式反应(PCR)扩增基因组DNA的模板而产生。其优点有①所需DNA用量少；②技术能够获得更高的信息量③不需要预先知道扩增基因组的序列特征等信息。尽管AFLP技术具有很多优点，但也存在一些缺点,主要表现在以下方面：①所需仪器和药品价格昂贵,实验成本较高；②操作复杂，对实验人员的技术水平要求较高。该技术已应用于小麦、水稻、玉米、大豆和棉花等主要农作物^[13]。SSR标记法是指以少数几个核苷酸（1～4个）为单位多次串联重复的DNA序列，分布于常染色质区，是真核生物基因组重复序列的主要组成部分，广泛分布于基因组中。SSR广泛存在，并且进化变异速度非常快，使得能够检测到全基因组中多位点的变异，多态性较高。而缺点是需要预知靶标序列，技术难度较高。本次石竹属DNA指纹图谱由有ISSR、SRAP两种分子标记共同构建的。

1.4.1 SRAP标记

SRAP分子标记技术首先是由美国加州大学蔬菜作物系Li与Quiros^[15]于2001年在研究芸薹属作物时开发出来的。它独特的引物设计可检测基因的阅读框(ORFs)区域，是一种不需要任何序列信息即可直接进行PCR扩增的新型分子标记技术。

SRAP技术的基本原理是通过扩增一对引物对可阅读框进行的。其中正向引物长17 bp，5’端核心序列由10 bp无任何特异的填充序列(一般是TGAGTCCAAA，少数为TGAGTCCTTT)和CCGG组成,随后为3’端的选择性碱基，正向引物对外显子进行扩增。反向引物的组成与正向引物类似，区别在于反向引物长18 bp，核心序列由11 bp填充序列(GACTGCGTACG)和特异序列AATT组成，3’端仍为3个选择性碱基，反向引物对内含子区域和启动子区域进行扩增。因内含子、启动子和间隔序列在不同物种甚至不同个体间差异很大，从而可以与正向引物搭配扩增出基于内含子和外显子的SRAP多态性标记。SRAP标记系统引物设计的一般原则(如：不能有二聚体、发卡结构、GC含量为40% ~60%等)外，还有其独特之处。它针对基因组可阅读框的一些特点而设计，利用在不同个体中外显子的相对保守性及内含子和启动子的可变性，通过正反引物的组合搭配扩增出基于内含子与外显子的多态性标记。SRAP自诞生以来，以其操作简便快速、成本低、可信度高、易于测序等特点倍受分子生物学家的青睐。在遗传多样性研究方面，SRAP标记比其他标记具有更突出的优点，因此较多的研究者开始运用SRAP标记进行物种遗传，Ferriol等^[16]对甜瓜(Cu-curbita pepo)的2个变种69份变异类型材料进行遗传多样性分析，利用SRAP和AFLP两种分子标记和形态学分析，结果表明：分子标记手段与形态学分析存在一致的方面，除此，分子手段提供的信息更加详细，而且SRAP标记更优良。另外，Fufa^[17]等运用SRAP对硬红冬小麦进行了基因型比较和分类研究,结果表明：23对SRAP引物产生共产生了468条条带，其中有6条为非多态性条带，遗传多样性在0. 1~0. 9，平均为0. 418，试验可证明， SRAP在遗传多样性和基因型鉴定上有很好的应用前景。Budak等^[18]以野牛草为材料比较了RAPD、SSR、ISSR和SRAP 4种分子标记技术的优越性，发现SRAP具有最丰富的多态性和最强的区分能力。王从彦等^[13]对芫花的研究亦表明，SRAP是研究遗传多样性、品种鉴定和系统发生的有效的工具。除此以外在油茶Camellia oleiferaAbel.^[19]、荔枝Litchi chinen-sisSonn.^[20]、落羽杉Taxodium distichum(L.)Rich.^[21]、构树Broussonetia papyrifera( L.)Vent.^[22]、桃Prunus persica(L.)Batsch^[23] 等物种的分子鉴别、遗传多样性分析等方面SRAP标记法也得到广泛应用。

1.4.2 ISSR标记

ISSR(inter-simple sequence repeat)又称简单重复序列间扩增，是在SSR基础上发展起来的一类新型的分子标记技术，其引物开发费用低，具有操作简单，目前，ISSR标记已广泛地用于遗传作图品种鉴定、遗传多样性、基因定位、系统发育、分子标记育种等方面。植物基因组中散布有大量的DNA重复序列，根据其在基因组中的含量可分为轻度、中度和高度重复序列，根据其分布特征可分为散重复序列和串联重复序列，SSR是一种分布于常染色质区的高度串联重复序列，重复序列为2～6bp，是真核生物基因组重复序列的主要组成部分，均匀分布于基因组中,正是基于基因组的这种特点，才出现了SSR和ISSR分子标记技术。

ISSR是基于SSR发展起来的一种新型分子标记技术，它的基本原理就是在SSR的3’端或5’端加锚1～4个嘌呤或嘧啶碱基，并以此作为引物，通常为16～18个碱基序列，对两侧具有反向排列SSR的一段DNA序列进行扩增，然后再进行电泳、染色，根据谱带的有无及相对位置，来分析不同样品间ISSR标记的多态性。此外，ISSR技术除了引物设计要求不同外，原理和操作与SSR、RAPD非常相似，但其产物多态性远比RFLP、SSR、RAPD更加丰富，可以提供更多的关于基因组的信息。ISSR标记结合了RAPD和SSR的优点，具有模板需要量少、多态性丰富，无需试剂盒、结果记录方便、实验成本低、操作简单、实验稳定性较高等优点。但有PCR扩增时也有最适反应条件，因此需要一定时间摸索，其标记大多为显性标记。在解决交配系统、计算杂合度和父系分析等问题时效果不佳。引物设计是ISSR技术中最关键、最重要的一步。在选择ISSR引物时，应以二核苷酸重复序列为主，少选寡聚三核苷酸、四核苷酸引物；此外，尽管ISSR引物为通用引物，不像SSR引物那样需根据物种基因组特征合成引物，但研究中仍发现不同植物类群中,能够扩增出带纹的引物存在较大差异^[24]。