摘 要

杨树是我国重要的经济树种，但是其产量及质量较易受病虫害的影响。褐斑病是其中一种重要的病害，而杨生褐盘二孢菌是导致褐斑病的主要病原菌之一。本研究以杨生褐盘二孢菌的全基因组序列为基础，对其中一类可能在致病过程中发挥重要作用的含lysm结构域的基因进行了全长cDNA的克隆，并对其序列进行了生物信息学分析。研究发现其cDNA全长960bp，5'非编码区145bp，3'非编码区380bp，开放阅读框435bp，编码145个氨基酸，推测蛋白质分子量15.87kd。此后又进行了表达模式分析，发现该基因在杨生褐盘二孢菌的菌丝中表达，最后通过原核表达系统,在大肠杆菌BL21（DE3）PlysS中成功地表达出该基因，进一步纯化这一蛋白质后，发现其实际大小与理论预测一致。

关键词： 杨生褐盘二孢菌 lysm效应因子 全长cDNA克隆

Abstract

Poplar is one of the most important economic timber species，but the volume and quality of poplar production are easily influenced by pests. Poplar’s brown spot is one of the most important pathogens, mainly caused by Marssonina brunnea. The research is based on the whole genome sequence of Marssonina brunnea, synthesizing cDNA through reverse transcription of genes which include lysm structural domain and have significant effect on pathogenesis. The results are as follows. The total length of the cDNA was 960 bp, 5' non-coding region was 145 bp, 3' non-coding region was 380 bp, and the opening reading frame was 435bp. Also, we found 145 amino acids was coded by the cDNA and deduced molecular weight of the protein is 15.87kd. The results of expressing pattern analysis showed that the genes with lysm structural domain of Marssonina brunnea mainly expressed in hypha, and then through prokaryotic expression system, these genes were expressed in Bacillus coli BL21 (DE3) PlysS successfully. After protein purifying, the results showed its actual size and theoretically predicted size are exactly the same.

Key Words: Marssonina brunnea Lysm effectors Gene cloning

目 录

前 言 1

1. 文献综述 1

1.1 杨树的现状 1

1.1.1 杨树介绍及抗病研究 1

1.1.2 杨树的黑斑病 2

1.2 植物免疫系统机理 3

1.3 Lysm效应因子 4

1.3.1 lysm结构 4

1.3.2 lysm效应因子 4

1.3.3 lysm效应因子的可能作用机理 4

1.4 本论文的研究目的 4

2. 材料与方法 5

2.1 材料准备 5

2.1.1 材料 5

2.1.2 仪器与设备 5

2.2 试验方法 5

2.2.1总RNA提取与纯化 5

2.2.1.1 总RNA提取 5

2.2.1.2 DNase处理纯化RNA 5

2.2.2 单链cDNA的合成 6

2.2.3 基因克隆及载体构建 6

2.2.3.1 5'RACE和3'RACE扩增获得5'末端和3'末端序列 6

2.2.3.2 全长基因的克隆 8

2.2.3.3 载体构建 8

2.2.4 原核表达及纯化 9

2.2.5 Realtime PCR 10

2.2.6 序列测定及分析 11

3.结果与分析 11

3.1 RNA的提取 11

3.2 全长序列的获得及生物信息学分析 11

3.2.1 lysm基因全长序列获得 11

3.2.2.1 ProtParam 蛋白质序列理化参数 12

3.2.2.2 ProtScale蛋白质亲疏水性分析。 12

3.2.2.3 信号肽预测 13

3.2.1.4 结构域分析 14

3.2.1.5 Pyre预测蛋白质折叠 14

3.2.1.6 Swiss-Model workspace预测蛋白质二级结构 15

3.3 基因表达模式的分析 16

3.4 原核表达及纯化 16

4.讨论 17

致谢 19

参考文献： 20

前 言

杨树由于其具有耐干旱盐碱、分布广、种类多、早期速生、易无性繁殖、易杂交、易改良遗传特性，故广泛用于集约栽培，形成人工林，解决迅速恢复植被，木材问题和生态问题。通过大力营造用材林，用丰产栽培方式种植速生树种，带来巨大的经济效益、生态效益和社会效益。由于杨树病虫害情况严重，为林业生产带来巨大损失。为跨越这一瓶颈，就此进行了选择育种、杂交育种、多倍体育种、诱变育种等杨树树种的改良方法。其中，针对杨生褐盘二孢菌是杨树黑斑病的主要病原菌之一，对其效应因子进行克隆分析，并以此为基础研究杨树ETI应答以及杨生褐盘二孢菌的致病机理，可以为杨树的抗病育种提供理论依据。

1. 文献综述

1.1 杨树的现状

1.1.1 杨树介绍及抗病研究

杨树属于被子植物门(Angiosperms)双子叶植物纲(Dicots)杨柳科(Salicaceae)杨属(Populus)(The Angiosperm Phylogeny Group, 1998)。杨属植物为落叶树种, 主要分布于北纬19° ~70°之间的广大地区, 少数分布于热带非洲^[1]。中国储有丰富的杨树资源，从大小兴安岭的甜杨、大青杨，南方的滇杨，到西部耐旱、耐盐碱的胡杨，还有银白杨、银灰杨等。由于具有耐干旱盐碱、分布广、种类多、早期速生、易无性繁殖、易杂交、易改良等特点，杨树被广泛用于集约栽培。

中国的森林资源贫乏，每年国家需要进口大量木材。种植杨树，益处多多。通过大力营造用材林，用丰产栽培方式种植速生树种，能在短期内解决国家木材短缺问题。我国在杨树科学研究上，经引入与选育的一批优良无性系品种，大面积推广形成了巨大经济效益。在杨树培育的过程中，加工杨树木材产业随之兴起。80年代开始，苏北地区形成了由成片林、农田林网、四旁植树等组成的杨树栽培体系，尤其是“十五”期间，新一代杨树品种的培育成功和大量推广应用，从根本上改变了苏北地区缺材少林的状况，生态、经济和社会效益改善十分明显。随着杨树资源培育的发展，杨树加工产业也随之兴起，并逐渐成为苏北地区脱贫致富的主导产业^[2]。学会用科学的方法种植杨树，可以在短期内获得可观的收入。种杨树的最大好处就是杨树生长快，轮伐期短，一般5－8年到12年间便能采伐利用，投资见效快，收益多。进行丰产栽培技术组合成丰产栽培模式和配套技术，缩短轮伐期，提高产量以及木材的质量。其中在种植杨树的过程中还产生很大的生态效益和社会效益。在杨树病虫害防治方面，提出了有效方法与综合防治技术。目前在植物基因工程研究中常用的外源抗虫基因有苏云金杆菌结晶蛋白基因(Bt)、蛋白酶抑制剂基因(CpTI)、植物凝集素基因(Lec)、淀粉酶抑制剂基因、核糖体失活蛋白基因等^[3]。