摘 要

为探索美洲黑杨幼苗形层层细胞原生质体提取的适宜条件，并建立杨树形成层原生质体瞬时转化体系，以南林895杨的形成层细胞为材料，通过酶解法分离美洲黑杨形成层原生质体并确定最适分离条件。用PEG介导的瞬时转化法将GFP转化到杨树形成层细胞原生质体中。原生质体分离结果表明，酶解时间及纤维素酶浓度和果胶酶浓度对原生质体产量影响最大。以杨树形成层为材料分离原生质体的适宜条件为纤维素浓度（1%）、离析酶浓度（0.25%）、甘露醇浓度（0.4M）、酶解时间为（23h）。为了建立杨树原生质体的瞬时转化体系，通过PEG介导法将绿色荧光蛋白（GFP）导入到杨树形成层原生质体中，结果发现在激光共聚焦扫描显微镜(Visi-Tech)下（488nm）清楚的观察到GFP绿色荧光，这表明本研究成功建立杨树形成层原生质体瞬时转化体系，为探究形成层细胞在次生生长过程提供理想的试验平台。

关键词：杨树；形成层细胞；原生质体；瞬时转化

Protoplast isolation and transient transformation of Populus deltoides Marsh seedling cambium cells

ABSTRACT

This study tries to explore the optimal extraction conditions for the protoplast of the young Populus deltoides Marsh seedlings and to establish its genetic transformation system. The protoplast of Populus deltoides Marsh was isolated from cambium cells of Nanling 895 poplar and the optimal separation conditions were determined by enzymolysis. GFP was transformed into protoplasts of poplar cell by PEG mediated transient transformation. The results of protoplast isolation showed that the time of hydrolysis, the concentration of cellulase and pectinase concentration had the greatest influence on protoplast yield. The optimum conditions for the separation of protoplasts from the poplar formation layer are cellulose concentration R-10 (1%), Mazerozyme R-10(0.25%), D-mannitol concentration (0.4M), and enzyme hydrolysis time (23h). In order to establish the transient transformation system of poplar protoplasts, green fluorescent protein (GFP) was introduced into the protoplast of poplar cambium by PEG mediated method. The results were found under laser confocal scanning microscope (Visi-Tech)(488nm) clearly observed the green fluorescence of GFP, which shows that this study successfully established the transient transformation system of protoplast of poplar formation layer and provided an ideal test platform for the formation of the formation layer cells in the secondary growth process.

Keyword：Populus deltoides Marsh；Cambium cells；Protoplast；Transient transformation

目录

1 文献综述 1

1.1美洲黑杨 1

1.1.1美洲黑杨的特性 1

1.1.2美洲黑杨的价值 1

1.2维管形成层 1

1.2.1维管形成层的特性 1

1.2.2维管形成层的研究 2

1.3原生质体的制备 2

1.3.1原生质体的特性 2

1.3.2原生质体的研究 3

1.3.3原生质体制备的方法 4

1.4 PEG介导法 4

2 材料与方法 5

2.1材料 5

2.1.1试验材料 5

2.1.2试验试剂 5

2.1.3试验仪器 7

2.2试验方法 7

2.2.1原生质体分离 7

2.2.2原生质体纯化 7

2.2.3杨树形成层细胞原生质体瞬时转化体系的建立 8

3 结果与讨论 9

3.1.1杨树叶片原生质体分离情况 9

3.1.2杨树形成层原生质体分离情况 10

3.2 PEG介导杨树形成层细胞原生质体的瞬时转化 10

结 论 12

致 谢 14

参考文献 15

附录 16

1 文献综述

1.1美洲黑杨

1.1.1美洲黑杨的特性

美洲黑杨是杨柳目杨柳科杨属植物，因原产于美洲而得名。据形态特征又能分为I-69杨、I-72杨、南林351杨、南林95杨、南林895杨和35杨等。本研究以南林895杨为试验材料，用杨树幼嫩叶片为材料做预试验制备叶肉原生质体，再以幼嫩枝条为材料刮下形成层，制备形成层的原生质体。南林895杨，雌株，美洲黑杨×欧美杨F1无性系，具有美洲黑杨的基本形态特征，树形高大为乔木，干形通直，分枝粗度中等且树皮薄;叶片大而呈现心形，喜光照且不耐荫蔽，杨树适应性强，在光照水肥充足的情况下，生长十分迅速，较耐干旱瘠薄，具有较强的无性繁殖能力和遗传稳定性^[1]。

1.1.2美洲黑杨的价值

杨树木材材质洁白、柔软，易加工，可广泛用于包装用材、旋切用材和纤维用材。种类很多，在浙江省引种成功的杨树无性系主要为美洲黑杨，喜光照，不耐荫蔽，适应性强;耐水湿，又能耐程度不同的碱土，且生长迅速，是城市绿化和四旁植树的理想树种。此外，杨树具有生长快、适应性强、容易无性繁殖等优点, 是主要的用材树种, 也是林木生物学研究的“ 模式树种”^[1]。

1.2维管形成层

1.2.1维管形成层的特性

高等植物的形成层包括产生维管组织的维管形成层和产生周皮的木栓形成层, 但通常将前者简称为形成层^[2]。维管形成层（简称形成层）一般指双子叶植物和裸子植物的根茎中，位于木质部和韧皮部之间的一种分生组织，形成层细胞具有多能干细胞的特征，细胞分裂时一分为二，一个细胞保持形成层细胞的特性以维持形成层的功能，另一个细胞则向木质部前体细胞或韧皮部细胞分化。然后木质部和韧皮部前体细胞进一步分化为各种类型的细胞。与绝大多数双子叶植物和裸子植物一样,美洲黑杨在完成初生生长以后,原形成层仍可保留分生组织的特性,在发育形成初生维管组织的同时,进一步分化形成维管形成层^[3]。

1.2.2维管形成层的研究

近年来，我国学者对美洲黒杨的形成层的研究主要是从组织器官层面^[4,5]、细胞层面^[6]、基因层面^[7,8]等方向进行研究，尹增芳等人^[3,4]利用常规石蜡切片技术, 通过光学显微镜和电子显微镜观察研究了美洲黑杨维管形成层的发生和发育，郑佳等人成功分离和克隆了杨树形成层发育相关的WOX4基因，并发现WOX4基因可以促进植物的生长和发育^[8]。Chen H M, Han J J等人对杨树维管形成层活动周期的细胞形态结构及细胞壁成分研究,揭示出活动期维管形成层细胞径向壁和切向壁细胞壁的厚度明显变薄,而休眠期初生纹孔场之间的径向壁加厚,细胞分布层数变少,细胞壁出现念珠状结构^[27]。Johansson A等学者在芯片分析技术下发现，杨树形成层休眠期向活动期转变过程中,PttGA20ox会被诱导表达,进而刺激维管形成层的活动^[28]。植物维管形成层活动产生的次生生长非常旺盛，产生的次生木质部在人类社会生活和生产中发挥重大作用，所以维管形成层活动规律的研究具有重大生物学意义和生产应用价值^[26]。

1.3原生质体的制备

1.3.1原生质体的特性

植物原生质体是指经过除去细胞壁操作后仅有一层质膜包被的“裸露细胞”，内含细胞质和细胞核，具有细胞全能性，可以再生细胞壁并在适宜条件下能进行连续分裂，因此被广泛应用于遗传转化、细胞融合^[9]以及细胞体突变^[10-12]。植物原生质体的分离是植物原生质体培养的重要步骤之一，也是原生质体融合以及植物体再生研究的基础^[13]，植物原生质体是研究细胞生理功能的一种理想的材料，同时也是原生质体融合以及外源基因遗传转化的合适受体^[14]。原生质体的研究将为基因工程和细胞工程的研究提供广阔的前景^[1]。

1.3.2原生质体的研究

早在20世纪60年代初期,原生质体的研究就已经开始, 英国科学家Cocking(1960)第一次通过纤维素酶酶解细胞壁从而获得了有活性的植物原生质体, 自此开创了通过酶解法制备植物原生质体的试验方法。此外, 20世纪70年代初,Nagata和Takeble (1970)第一次将分离得到的烟草(Nicotiana tabacum)叶肉原生质体通过培养得到完整的再生植株, 自此证明了植物原生质体的细胞全能性, 可以再生细胞壁, 进行连续分裂^[15]。1975 年以色列的Vardi^[22] 等首次从木本植物甜橙Citrus sinensis 珠心组织生成的胚性愈伤组织,并从愈伤组织分离原生质体^[23]。2002 年, 谷晓峰^[24]等以8年生“罗田甜柿”为材料, 进行了原生质体培养及植株再生, 为甜柿的细胞工程和分子育种提供依据, 2003年, 通过秋水仙素处理后, 获得了同质12 倍体的倍性变异株^[25]。原生质体没有细胞壁适合作为原生质体融合的材料，2007年，郭传敏以南林895杨(Populus×euramericana cv ‘Nanlin895’)、转Bt基因南林895杨和银白杨(P.alba)为材料,建立悬浮细胞系,采用电融合的方法完成原生质体电融合及杂种筛选和培养，在使用酶液完成原生质体分离的时候，研究发现纤维素酶与果胶酶，离析酶等搭配使用时，原生质体的产量显著增加，其中果胶酶Pectolyase Y-23效果最好^[16]。在电融合试验中发现，过高的AC强度和DC强度，不利于融合后的继续培养，同时融合率也会下降。此外, 可利用原生质体进行离子通道研究, 以了解诱导子、渗透压及机械刺激等外界刺激下原生质体的调节机制^[15,17-19]。近年来，杨树原生质体研究取得了较大进展, 我国学者在该研究方面做出了较大的贡献, 获得了原生质体再生植株。但是目前能够获得再生植株的杨树品种比较少^[1]，本文旨在探讨影响杨树形成层原生质体提取效率的因素（如酶解液配方、酶解时间及处理转速等），探索高效的杨树原生质体提取方法，并在此基础上建立杨树形成层原生质体的瞬时表达体系，为探究形成层细胞在次生生长过程提供理想的试验平台。

1.3.3原生质体制备的方法

植物原生质体培养方法起源于植物单细胞的培养方法^[30]。1954年，植物单细胞培养才获得成功。Mllir 培养的万寿菊及烟草悬浮细胞植入到长有愈伤组织的培养基上得到了它们的单细胞克隆，并建立了看护培养的方法；1960年Jones等建立了微室培养法^[30]。同年Cocking应用酶法分离原生质获得成功，从而在试验条件下很容易获得大量的原生质体。随着多种适用于原生质体分离的商品酶的出现，原生质体的培养方法也得到了不断地改进，其中酶解法分离原生质体是一个常用的技术，其原理是基于植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成，因而使用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分，除去细胞壁，获得原生质体^[31]。酶液通常需要保持较高的渗透压，以使原生质体在分离前细胞处于质壁分离状态，分离之后不致膨胀破裂。渗透剂常用甘露醇，山梨醇，葡萄糖或蔗糖。酶液中还应含一定量的钙离子，来稳定原生质膜。游离出来的原生质体可用过筛一低速离心法收集，用蔗糖漂浮法纯化，然后进行培养。

1.4 PEG介导法

在基因工程中建立合适的外源基因转移系统是一个至关重要的方面。外源基因的瞬时表达能够在短时间内确定外源基因是否转移到植物细胞中，从而确定重组质粒DNA上的启动子对于某一受体系统是否有效^[20]。植物原生质体可以用于遗传转化研究中，据文献报道，将外源基因导入原生质体的方法途径有很多，例如农杆菌转化法、显微注射法和PEG介导转化等^[15]。目前PEG介导法运用最广泛。PEG（polyethylene glycol）聚乙二醇是由HO-(CH₂CH₂O)_n -H链单位构成的大分子聚合物，为高分子多聚物，具有一系列分子量，显示不同的水溶性。分子链中含有许多易于和金属阳离子形成配价键的氧原子，最初是用作原生质体融合剂^[21]。20世纪80年代以后PEG被逐渐用于外源基因直接转化植物原生质体的诱变剂，以PEG6000和4000最为常用。PEG具有细胞粘合及扰乱细胞膜磷脂双分子层的作用，高浓度的PEG具有极强的亲水性，能够吸附溶液中的自由水分子使细胞膜之间或DNA与细胞膜之间形成分子桥，促使相互间的接触和粘接从而导入外源基因^[21]。同时由于其本身带有许多正电荷，可以引起膜表面电荷紊乱干扰细胞识别，有利于细胞膜间的融合和外源DNA进入原生质体^[21]。

2 材料与方法

2.1材料

2.1.1试验材料

1)选取由南京林业大学提供的南林895杨（美洲黑杨×欧美杨F1无性系）幼苗，用刀片沿茎段刮下形成层。

2)预试验用的是杨树幼嫩的叶片。