摘 要

启动子是在基因表达调控中用于调控基因转录的重要元件。目前植物基因工程中常使用CaMV35S启动子，它属于组成型启动子，在它的驱动下，目的基因可在不同组织器官和发育阶段高效表达。但大量异源蛋白质或代谢产物在植物体内积累，打破了植物原有的代谢平衡，甚至产生毒害，可能转基因植物发育异常，甚至导致死亡。

相较于组成型启动子，诱导型启动子拥有更多的优势和潜力。在可诱导的系统的控制下，目的基因可以在植物特定阶段高效表达。雌二醇诱导启动子和地塞米松（DEX）诱导的启动子已应用于拟南芥、烟草和水稻等植物基因工程研究中，研究结果表明，雌二醇的诱导拟南芥和烟草植株GFP蛋白表达水平是35SGFP的八倍，而未经诱导的植株没有检测到蛋白的转录。

杨树是木本植物的模式物种。为了了解雌二醇诱导启动子和DEX诱导的启动子是否适用于杨树，因此本论文将报告基因GUS通过LR反应，构建了植物表达载体pER8-GUS和pTA7001-GUS,GUS基因分别受雌二醇诱导启动子和DEX诱导的启动子驱动。经菌液PCR检测正确的重组子，采用液氮冻融法转入农杆菌菌株EHA105中，并采用农杆菌介导进行山新杨（Populus davidiana × P. bolleana）叶片遗传转化和GUS基因的瞬时表达。研究结果表明，0.2μM的雌二醇在24小时即可诱导GUS基因表达，表达强度远高于35S启动子。而DEX诱导的启动子没观察到活性。

关键词:雌二醇；DEX；诱导型启动子；山新杨

Research on Induction Efficiency in Poplar of DEX and Estrogen Induced Promoter

Abstract

Promoter is the key component of gene expression which regulates and controls genes’ transcription. Currently, CaMV35S promoter was widely used in plant genetic engineering. CaMV35S is a constitutive promoter, and with its’ promotion, the target gene can express efficiently in all development stages of different tissues and organs. However, a great deal of target protein or metabolic products accumulate in plants, which may break the original metabolic balance or even be toxic. So many transgenic plants develop abnormal or even die.

Comparing with constitutive promoters, the inducible promoters have more advantages and potential. Under the control of the inducible system, the target gene can have efficiently expressed at certain stage. Estrogen inducible promoter and DEX inducible promoter have been used in plant genetic engineering such as Arabidopsis, tobacco and rice etc. And the results showed that GFP expression level under estrogen induced in transgenic Arabidopsis and tobacco is eight times of that of 35SGFP, and there was no sign of protein transcription in the plants without induction.

Poplar is a model species of woody plants. In order to find out whether the estrogen inducible promoter and DEX inducible promoter are suitable for poplar or not, in this paper, the reporter gene, GUS, was cloned into plant expression vector pER8-GUS and pTA7001-GUS by LR reaction, in which GUS was respectively drove by the estrogen inducible promoter and DEX inducible promoter. The recombinants which were proved by PCR Detection were transferred into Agrobacterium strain, EHA105, by liquid nitrogen freezing method, and were transformed into the leaf discs of Shanxin poplar, a hybrid of Populus davidiana × P. bolleana for GUS transient expression. The result shows that 0.2μm estrogen can efficiently induce GUS expression within 24 hours and its expression intensity was much higher than that of 35S promoter. However, the DEX inducible promoter was not observed active.

Keywords: estrogen; DEX; inducible promoter; Shanxin poplar

目 录

1 文献综述 - 1 -

1.1 启动子 - 1 -

1.1.1 启动子的概述 - 1 -

1.1.2 启动子的分类 - 1 -

1.2 诱导型启动子 - 3 -

1.2.1 诱导型启动子的分类 - 3 -

1.2.2 诱导性启动子研究方法 - 4 -

1.3 植物基因的瞬时表达的方法与应用 - 5 -

1.3.1 植物瞬时表达技术的方法 - 5 -

1.3.2 植物瞬时表达技术的应用 - 7 -

1.4 报告基因 - 8 -

1.4.1 报告基因概述 - 8 -

1.4.2 报告基因的类型和特点 - 9 -

1.4.3 报告基因的应用 - 10 -

1.5 本论文的研究目的与意义 - 11 -

2 材料与方法 - 13 -

2.1 材料 - 13 -

2.1.1 植物材料 - 13 -

2.1.2 仪器与设备 - 14 -

2.1.3 培养基 - 14 -

2.1.4 菌株与载体 - 14 -

2.2 实验方法 - 16 -

2.2.1 质粒提取 - 16 -

2.2.2 利用LR技术构建GUS报告基因植物表达载体 - 17 -

2.2.3 CaCl₂法快速制备大肠杆菌感受态 - 17 -

2.2.4 大肠杆菌转化 - 18 -

2.2.5 大肠杆菌菌液PCR检测阳性菌落 - 18 -

2.2.6 农杆菌感受态制备 - 19 -

2.2.7 农杆菌转化 - 20 -

2.2.8 农杆菌菌液PCR检测阳性菌落 - 20 -

2.2.9 山新杨叶片的瞬时表达 - 20 -

2.3.10 GUS染色 - 21 -

3 结果与分析 - 23 -

3.1 载体构建及PCR检测 - 23 -

3.1.1 pTA7001-GUS的构建及PCR检测 - 23 -

3.1.2 pER8-GUS的构建及PCR检测 - 23 -

3.1.3 液氮冻融法转化根癌农杆菌EHA105 - 24 -

3.2 不同启动子在杨树叶片中的表达效率 - 25 -

3.2.1 CaMV35S启动子在杨树叶片中的表达效率 - 25 -

3.2.2 培养基中施加不同浓度的DEX与雌二醇 - 26 -

3.2.3 雌二醇诱导型启动子在杨树中的诱导效率 - 27 -

3.2.4 DEX诱导型启动子在杨树中的诱导效率 - 29 -

结 论 - 31 -

致 谢 - 33 -

参考文献 - 34 -

1 文献综述

无论是在基础植物生物学研究还是生物技术应用中，最为理想的方式莫过于能够精确的控制基因的表达时间或者位置。因此，相较于组成型启动子而言，诱导型启动子具有众多的优势和潜力。在可诱导的系统的控制下，在特定的发育阶段转基因可以对既定的目标进行持续表达。

基因表达的调控过程中分为两个阶段，处于转录阶段的调控包括转录前调控、转录调控、转录后调控，处于翻译阶段的调控分为翻译调控和翻译后调控，其中顺式作用元件与反式作用因子之间的相互作用是其在转录过程之所以能够实现对表达基因进行调控的原因。而在转录过程中密切参与了对于下游关联基因表达调控的诸多重要的顺式元件是植株能够在繁复多变的生长环境下适应生存的关键所在。开展对于植物启动子的研究能够加深对基因转录调控的表达模式和其调控机制的了解，并应用在基因工程中，从而达到提高或改进外源目的基因表达的目的^[1]。

1.1 启动子

1.1.1 启动子的概述

启动子是一段DNA序列，与RNA聚合酶识别与结合后起始转录。生物在生长发育中都会根据自身状态和外界环境定时、定位、定量地表达特定基因，这是通过生物的DNA顺式作用元件与反式作用因子或环境中的热、光等因素的互作来实现的，然而在所有调控元件中启动子的作用尤为关键^[2]。

1.1.2 启动子的分类

通常按照转录方式分类，可将植物启动子分成3类：组成型、组织特异型和诱导型。如几乎所以果实的特异性启动子都可划分为乙烯诱导型启动子，因其均含有着乙烯应答元件。但物启动子的分类并不是绝对的。一种类型的启动子通常也会具有一些其他类型启动子的特性，这意味着一个植物启动子可能兼有两种或者更多类型启动子的特点。

（1）组成型启动子