摘 要

浙江红山茶(Camellia Chekiangoleosa)为常绿树种，树形优美、叶色深绿，冬末春初开花，花大、色彩艳丽，是非常重要的冬春开花的观赏树种。此外，浙江红山茶的种子产生的茶油富含不饱和脂肪酸，是高质量的食用油。近年来，随着人们对油茶经济价值认识的提高，利用分子生物学手段来进行油茶改良是今后研究的重要方向。本研究在浙江红山茶转录组测序获得的EST序列的基础上，通过RACE技术等克隆浙江红山茶肉桂酸羟化酶C4H基因的全长，并进行生物信息学分析，为研究浙江红山茶中花青素的合成途径建立基础。浙江红山茶的C4H基因全长1741bp，包含一个1515bp的开放阅读框，编码505个氨基酸。分子量约为58.06kDa，等电点PI=9.32。不稳定系数为46.14，说明该蛋白不稳定（大于40）。总平均亲水性-0.227。Blastn显示与金银花C4H的同源性为83%。C4H编码蛋白无信号肽，是非分泌蛋白。二级结构预测显示该蛋白包含了49.70%的α螺旋、11.49%的延伸链、6.34%的β折叠和32.48%的无规则卷曲。选择10个具有代表性物种的C4H氨基酸序列，用邻接法构建了系统发生树。结果表明浙江红山茶C4H与树棉的亲缘关系最近。

关键字：浙江红山茶、肉桂酸羟化酶、基因克隆、生物信息学分析

Abstract

Camellia chekiangoleosa is an important species of genus Camellia belonging to the family Theaceae. It is an evergreen ornamental tree, consisting of big and colorful flowers that generally bloom between February and March. In addition, The seeds of C. chekiangoleosa can be used to extract high quality edible oil which is rich in unsaturated fatty acids. In recent years, the economic value of Camellia has been widely concerned, more and more studies focus on Camellia improvement by molecular biology methods. In this research, based on C.chekiangoleosa transcriptome database, cDNA encoding C4H was isolated and cloned from flowers of C.chekiangoleosa. Bioinformatic analysis was performed, laid a good foundation for anthocyanin biosynthesis research. C.chekiangoleosa C4H gene full-length cDNA is 1741bp, contains a 1515 bp open reading frame which encodes 505 amino acid residues. Molecular weight is 58.06kDa, isoelectric point PI = 9.32. Instability coefficient is 46.14 which indicated that the protein is unstable. Total average hydrophilicity is -0.227. Its nucleotide sequence shared 83% homology with Lonicera japonica. C4H has no signal peptide and is a non-secretory protein. The protein secondary structure prediction showed that it contains 49.70% of α helix, 11.49% of extended strand, 6.34% of β fold and 32.48% of random coil. We selected ten C4H proteins of various species to construct a phylogenetic tree by neighbor-joining method. The result demonstrated that the relationship between C.chekiangoleosa and Gossypium arboreum is the closest.

Keywords: Camellia Chekiangoleosa; cinnamic acid 4-hydroxylase; Gene cloning; Bioinformatics analysis

目录

1文献综述 4

1.1浙江红山茶生长习性、用途及研究进展 4

1.1.1 浙江红山茶的生物学特性、分布及利用 4

1.2 浙江红山茶的发展问题及现状 4

1.3油茶常规育种的研究进展 5

1.3.1油茶的选择育种 5

1.3.2油茶杂交育种 5

1.3.3油茶的离体培养育种 6

1.3.4 油茶的辐射育种 6

1.4.油茶分子水平上的研究进展 6

1.4.1 同工酶技术 6

1.4.2分子标记技术 7

1.4.3花色相关基因克隆研究进展 7

1.5实验研究目的与意义 8

2、 材料与方法 9

2.1实验材料 9

2.2实验仪器 9

2.3 实验方法 9

2.3.1 总RNA的提取 9

2.3.2单链cDNA的合成 9

2.3.3 3'RACE套式PCR 10

2.3.4 5'RACE套式PCR 10

2.3.5 目的片段回收及载体连接 14

2.3.6 大肠杆菌Top10转化及阳性克隆的PCR验证 15

2.3.7 序列分析 15

3实验结果与分析 15

3.1浙江红山茶C4H基因全长的克隆 16

3.2 浙江红山茶C4H二级结构预测 16

3.3 浙江红山茶C4H三级结构预测 16

3.4 浙江红山茶C4H蛋白质跨膜信号预测 17

3.5 浙江红山茶C4H编码蛋白的前导肽分析 18

3.6 浙江红山茶C4H亚细胞定位分析 18

4 讨论 19

5 参考文献 19

1文献综述

1.1浙江红山茶生长习性、用途及研究进展

1.1.1 浙江红山茶的生物学特性、分布及利用

浙江红山茶为常绿小乔木，高3-6米，树皮灰白色，平滑不裂，小枝光滑无毛。叶革质，长椭圆形，倒卵状椭圆形，以至矩圆形，表面亮绿色，背面青绿色，两面均光滑无毛。边缘疏生骨质透明之细锯齿，微向外卷。长7-12cm，宽2.5-5.5cm，叶柄粗壮，长0.8-1.6cm，无毛。花单生枝顶，直径8-10cm，艳红色，雄蕊深黄色，称两轮排列，雌蕊长2.5-4cm，花柱单一，线状，2/3以上星三列，子房无毛。蒴果球形，卵球形，厚木质，直径4-6cm，基部萼片宿存。每室含种子3-8粒，种子半球形，直径约2cm。

浙江红山茶主要分布于浙江丽水市庆元、龙泉、景宁、云和、青田、遂昌、松阳、仙居、平阳、泰顺、及开化等市县山区，及湖南、湖北、江西、福建、皖南山区也有分布。它是我国浙江、江西、福建、安徽等省山区的特有树种，集观赏、油用、药用等价值于一身，是山茶新品种培育的物质基础和杂交育种的重要亲本，具有重要的观赏价值和经济价值。浙江红山茶冬春开花，花大色艳，已成为蜚声中外的园林观赏植物珍品。在木本食用油和花卉生产中有着巨大的潜在价值。诗人苏轼吟云南山茶花诗曰：“山茶相对阿谁栽？细雨无人我独来，说似与君君不会，烂红如火雪中花”。当代诗人郭沫若诗云：“人人都说牡丹好，我道牡丹不及茶”。浙江红山茶植株形态优美，叶色翠绿，花大，色彩艳丽。丛植早春开花时绯红一片，美不胜收。孤植于花坛中央或假山石旁，均能自成美景。若与花期相近的玉兰、深山含笑、腊梅等树木混植，更是相得益彰。其抗寒性强，为山茶抗性育种的优良亲本，深受广大园林科技工作者的重视。浙江红山茶不仅在中国金华山茶物种园争芳斗艳，而且远涉重洋，在英国、法国、瑞士、德国、韩国、日本、澳大利亚、新西兰、美国、加拿大等国安家落户，并繁衍后代。1972年7月，在南非著名城市依凡拉的里得艺术馆举办的国际植物科学画展上，浙江红山茶独领风骚，被选定为画展的张贴宣传画，一时间，中国浙江红山茶开遍了南非主要城市的大街小巷，大放光彩。 这都很大程度的提高了红山茶的经济效益^[1]。

1.2 浙江红山茶的发展及现状

虽然油茶在我国已具有2300多年的栽培历史。早在南宋年间就已经开始有了种植油茶的现象，到明末时，在油茶的选种、种子处理、贮藏、育苗、整地和造林等方面取得了一定的成就和发展。然而尽管栽培时间较长，并且在长期的生产实践中积累了不少经验，直到新中国成立前，我国油茶的生产仍处于半荒芜状态^[2]。油茶在我国栽培历史虽久，但是目前对油茶的进一步开发、研究、应用仍不尽人意，油茶生产还存在诸多问题：(1)茶林处于荒芜的半野生状态，缺乏有效合理的抚育管理，导致杂草灌木丛生，大乔木大量侵入，与油茶争水争肥。有的林分稀密不匀，通风透光不良，病虫害严重，影响油茶开花结实，产量极低或根本没有产量^[3-4]。(2)遗传分化严重，种质杂乱，良种水平低。(3)深加工技术发展较快，但还需全面提高。目前一直停滞在粗榨毛油的基础上，以作坊式生产为主，对产品质量控制技术能力差。有的加工出来后短时间皂化值就大大上升，茶油品质变劣^[2;5]。(4)化程度低，油茶产量和市场占有率仍处于很低的水平，很多产品处于无牌不规范的生产经营中，没有形成品牌。(5)工企业缺乏市场竞争力。当前茶油产品生产、销售企业已有上百家，但大多规模偏小、资金不足、技术投入不够、竞争力不强、销售渠道不畅，与国内品牌油茶相比，难以开拓新市场^{[3; 6]}。

1.3油茶常规育种的研究进展

常规育种是指原生质体、细胞、组织、器官、个体等水平上的育种，方法主要包括选择育种、杂交育种（又称组合育种或重组育种）、物理及化学诱变育种、离体组织培养育种（包括花药及花粉单倍体育种、原生质体融合或体细胞杂交等）、多倍体育种等。

1.3.1油茶的选择育种

选择育种是指从现有的种质资源群体中，选出优良的自然变异个体，使其繁殖后代来培育新品种的一种育种方法。油茶林品种混杂，良莠不齐，产量不高，因此全国各地都开展了油茶良种的选育，一些优良的单株、家系和无性系等被选出来建林。20世纪60年代中后期，湖南省首先广泛开展了油茶良种选育工作^[7]。20世纪70年代末和80年代初，全国共选出油茶优树1.6万多株，为油茶育种提供了较好的材料^[8]。在油茶优树选择的基础上，20世纪80年代开始至今，人们对选定的优树种子进行育苗、造林，对实生子代进行比较试验，获得优良家系，同时通过布置各种无性系测定林开始油茶优良无性系的鉴定选育工作，都获得了成功。如中国林科院亚热带林业研究所于1986年选育出亚林1、亚林2、亚林6三个优良家系^[9]。2004年，陈永忠等通过在优树无性系的基础上进行优良无性系选育和半同胞子代测定，选育出XLC6等6个油茶优良无性系^[10]。2008年，韦长江等对在广西三门江林场建立的来自广西各地的175个油茶家系测定林，初步选择出立农106、立农2等8个家系为优良家系，选择效果良好^[11]。

1.3.2油茶杂交育种

杂交育种是指通过杂交来培育新品种或品系的育种方法。通过有性杂交育种，杂交子代可以综合双亲的优良性状，削弱亲本的不良性状，甚至某些优良性状超过亲本，因此可以选育出生长指标好，环境适应能力强，经济价值高，抗病虫害能力强的植株。

我国山茶属杂交育种工作开展于20世纪70年代，重点在茶叶和观赏类山茶花，并获得了不俗的成绩。例如庄瑞林等通过对山茶属8个物种进行24个组合的杂交试验，获得了杂交亲和能力最强的普通油茶和小果油茶正交组合^[12]。20世纪90年代初，我国油茶杂交育种研究得到进一步提升，高品质油茶培育获得了较大的成功。陶源等对5种不同果形、果色的自然类型进行杂交，结果表明，普通油茶种内不同品种类型间的杂交亲和力都很强^[13]。周盛等在2001年首次将产油量列为杂交育种的指标，通过比较普通油茶、江西小果油茶、越南油茶等3个种间杂交一代的生长指标，选出6个有突出优良性状的杂种单株^[14]。龚春等在2011年通过油茶远缘杂交育种试验，初步得出白皮中子（父）×赣无2（母）、白皮中子（父）×赣无1（母）及泰顺粉红（父）×赣55（母）的杂交种子均表现出果大、皮薄、出籽率高、含油率高的特点，目前选出的品种已播种培育，其后期表现有待进一步研究^[15]。

1.3.3油茶的离体培养育种

离体培养是指在含有营养物质及植物生长物质的培养液中，培养离体植物组织（器官或细胞）并诱导使其长成完整植株。但国内外关于油茶组织培养的报道还不多。1980年，颜慕勤等首次油茶种子中的子叶的基部诱导出胚状体，并成功长成植株^[16]。1982年卢天玲利用油茶未成熟子叶、幼胚离体培养获得植株^[17]。1984年，颜慕勤等报道了用油茶腋芽诱导获得再生植株，用组培和快速繁殖的小苗造林后，各项生长指标均等于或超过实生苗^[18]。